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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 小片段基因文库构建中载体的选择
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-06 23:54:34
基因组用sau3A酶切，再跑电泳后，我的目标目标片段（2-6kb)是用胶回收试剂盒回收好呢？还是用电洗脱方法回收好呢？因为我看很多人说试剂盒回收后含量会降低，我们实验室没有核酸含量测定的仪器，只能自己大概估计。...

你小试酶切结果咋样？基因组要多切些..
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11楼2012-11-07 00:29:00
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
我们一般构建cosmid文库...可插入外源片段30-50kb.
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12楼2012-11-07 00:31:41
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-11-07 00:29:00
你小试酶切结果咋样？基因组要多切些.....

我还没做到那一步，就想先问清楚了，到时候出问题了就知道怎么办了？
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nothing isimpossible
13楼2012-11-07 18:35:45
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-11-07 00:28:18
切胶后，不需要酚氯仿抽提，如果浓度可以的话，直接连接。...

您好：现在我在提基因组时就出问题了，我是用溶菌酶，蛋白酶K处理后，用异丙醇析出DNA，再用酚，氯仿抽提。上学期也做过这个菌的基因组提取，效果还挺好，可是最近连着做了三次，都没有做出来。三次的现象是这样的：
第一次：取4ml菌，在蛋白酶K处理后，离心，取上清，可是沉淀是很粘稠的一坨，吸不上来；最后在加入异丙醇后，没有丝状物出现（上次是有丝状物出现）。怀疑菌量太多。
第二次“取1.5ml菌，蛋白酶K处理后，溶液离心，一点都不粘稠，很容易就把上清分离出来，但是加入异丙醇后还是没有丝状物出现，只是变浑浊了，直到最后一步，也没有沉淀出现。
我一直怀疑是在溶菌酶处理，蛋白酶K处理时有问题，但都是按之前的步骤来的，怎么也提不出来。
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nothing isimpossible
14楼2012-11-12 00:20:56
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
我们一般先加溶菌酶处理一段时间30-60min，再加蛋白酶K处理10min。离心，上清使用酚氯仿抽提。2倍体积的无水乙醇沉淀.
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15楼2012-11-12 09:18:53
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putusbtc1

新虫 (初入文坛)
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16楼2013-05-22 06:56:09
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