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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-11-06 23:54:34
基因组用sau3A酶切,再跑电泳后,我的目标目标片段(2-6kb)是用胶回收试剂盒回收好呢?还是用电洗脱方法回收好呢?因为我看很多人说试剂盒回收后含量会降低,我们实验室没有核酸含量测定的仪器,只能自己大概估计。...

你小试酶切结果咋样?基因组要多切些..
11楼2012-11-07 00:29:00
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

我们一般构建cosmid文库...可插入外源片段30-50kb.
12楼2012-11-07 00:31:41
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-11-07 00:29:00
你小试酶切结果咋样?基因组要多切些.....

我还没做到那一步,就想先问清楚了,到时候出问题了就知道怎么办了?
nothing isimpossible
13楼2012-11-07 18:35:45
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-11-07 00:28:18
切胶后,不需要酚氯仿抽提,如果浓度可以的话,直接连接。...

您好:现在我在提基因组时就出问题了,我是用溶菌酶,蛋白酶K处理后,用异丙醇析出DNA,再用酚,氯仿抽提。上学期也做过这个菌的基因组提取,效果还挺好,可是最近连着做了三次,都没有做出来。三次的现象是这样的:
第一次:取4ml菌,在蛋白酶K处理后,离心,取上清,可是沉淀是很粘稠的一坨,吸不上来;最后在加入异丙醇后,没有丝状物出现(上次是有丝状物出现)。怀疑菌量太多。
第二次“取1.5ml菌,蛋白酶K处理后,溶液离心,一点都不粘稠,很容易就把上清分离出来,但是加入异丙醇后还是没有丝状物出现,只是变浑浊了,直到最后一步,也没有沉淀出现。
我一直怀疑是在溶菌酶处理,蛋白酶K处理时有问题,但都是按之前的步骤来的,怎么也提不出来。
nothing isimpossible
14楼2012-11-12 00:20:56
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

我们一般先加溶菌酶处理一段时间30-60min,再加蛋白酶K处理10min。离心,上清使用酚氯仿抽提。2倍体积的无水乙醇沉淀.
15楼2012-11-12 09:18:53
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putusbtc1

新虫 (初入文坛)

MER&CIEL ELISA KIT 试用装限量发送中
16楼2013-05-22 06:56:09
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