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地图上的街

新虫 (初入文坛)

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专业: 生物化学

[求助] 师妹跪求指导!!!P1转导的问题

各位好，我现在在做P1转导，但是做了几次都没转导成功。我用的供体菌是实验室的含Cm抗性的DH1。受体菌是W3110（rec+），DH1(rec-)。原P1的滴度是3.6*10e10，裂解液的滴度是6.3*10e9。
我做的转导成功的话应该是在Cm抗性板上有菌落出现，但是做了几次一直没出现抗性转导子。后来考虑转导时的菌量不够，就扩大了10倍菌，P1量不变，也没有结果。请各位前辈，做过P1转导的同学帮帮忙！！！感激不尽啊。。

具体实验操作是这样的：
P1裂解液的制备
1、接种E.coli供体菌株于5mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。
2、将供体菌液按1/100转接到5mlLB液体培养基。
3、37℃摇床培养45min。
4、取100μl滴度为109 ~ 1010 pfu/ml P1vir噬菌体原液与供体菌稀释液混合。
5、继续摇床培养，直到供体菌溶解，培养液变澄清。
6、加入几滴CHCl3，继续摇床培养2min。
7、将上层清液转移到35ml的离心杯中， 9200g，4℃离心10 min 。
8、将上清液移至新管中，以0.45 nm孔径过滤器(filter)去除残余菌体。然后将滤液转移到5mlEP管中，标记上宿主菌（如P1vir·W3110)和日期，4℃保存。
P1转导
9、接种E.coli受体菌于5mlLB培养液中，37℃培养过夜。
10、第二天，按1/100转接到5mlLB液体培养基，37℃，1h后取全部受体菌培养液于离心管中，室温下以最大速度离心2min。
11、倒出上清，以灭菌的P1盐溶液混悬受体菌到0.5ml。（足够两次转导）
12、分别取100 μl上述混悬液与1，10，100 μl P1裂解液混合，加入干净无菌的试管。作为对照，其中一支试管只加受体菌不加裂解液。
13、37℃保温30min，对照组同样处理。
14、加1ml LB液体培养基和200μl 1M柠檬酸盐。（柠檬酸钠盐螯合钙，可以减少P1二次吸附）
15、37℃通气培养1h。
16、将四组培养液转移离心管中，室温下以最大速度离心2min，弃去上清液。
17、以 100 μl缓冲液或肉汤（含100mM柠檬酸钠）重悬菌体。将全部混悬液涂布到相应的选择性培养基上，同时设置一皿涂布100 μl P1储存液作对照组。37℃培养过夜
18、观察统计菌落生长情况。
19、从涂布P1噬菌体最少的平板上挑出单菌落，通过平板划线法分离出单克隆。37℃培养过夜。重复一次该操作。
20、通过PCR确定转导后受体菌的基因型。

[ Last edited by 地图上的街 on 2012-11-1 at 09:41 ]

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