| 查看: 1049 | 回复: 0 | ||
[求助]
师妹跪求指导!!!P1转导的问题
|
|
各位好，我现在在做P1转导，但是做了几次都没转导成功。我用的供体菌是实验室的含Cm抗性的DH1。受体菌是W3110（rec+），DH1(rec-)。原P1的滴度是3.6*10e10，裂解液的滴度是6.3*10e9。 我做的转导成功的话应该是在Cm抗性板上有菌落出现，但是做了几次一直没出现抗性转导子。后来考虑转导时的菌量不够，就扩大了10倍菌，P1量不变，也没有结果。请各位前辈，做过P1转导的同学帮帮忙！！！感激不尽啊。。 具体实验操作是这样的： P1裂解液的制备 1、接种E.coli供体菌株于5mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。 2、将供体菌液按1/100转接到5mlLB液体培养基。 3、37℃摇床培养45min。 4、取100μl滴度为109 ~ 1010 pfu/ml P1vir噬菌体原液与供体菌稀释液混合。 5、继续摇床培养，直到供体菌溶解，培养液变澄清。 6、加入几滴CHCl3，继续摇床培养2min。 7、将上层清液转移到35ml的离心杯中， 9200g，4℃离心10 min 。 8、将上清液移至新管中，以0.45 nm孔径过滤器(filter)去除残余菌体。然后将滤液转移到5mlEP管中，标记上宿主菌（如P1vir·W3110)和日期，4℃保存。 P1转导 9、接种E.coli受体菌于5mlLB培养液中，37℃培养过夜。 10、第二天，按1/100转接到5mlLB液体培养基，37℃，1h后取全部受体菌培养液于离心管中，室温下以最大速度离心2min。 11、倒出上清，以灭菌的P1盐溶液混悬受体菌到0.5ml。（足够两次转导） 12、分别取100 μl上述混悬液与1，10，100 μl P1裂解液混合，加入干净无菌的试管。作为对照，其中一支试管只加受体菌不加裂解液。 13、37℃保温30min，对照组同样处理。 14、加1ml LB液体培养基和200μl 1M柠檬酸盐。（柠檬酸钠盐螯合钙，可以减少P1二次吸附） 15、37℃通气培养1h。 16、将四组培养液转移离心管中，室温下以最大速度离心2min，弃去上清液。 17、以 100 μl缓冲液或肉汤（含100mM柠檬酸钠）重悬菌体。将全部混悬液涂布到相应的选择性培养基上，同时设置一皿涂布100 μl P1储存液作对照组。37℃培养过夜 18、观察统计菌落生长情况。 19、从涂布P1噬菌体最少的平板上挑出单菌落，通过平板划线法分离出单克隆。37℃培养过夜。重复一次该操作。 20、通过PCR确定转导后受体菌的基因型。 [ Last edited by 地图上的街 on 2012-11-1 at 09:41 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
304求调剂
已经有3人回复
-
材料专硕306英一数二
已经有3人回复
-
0703化学调剂
已经有3人回复
-
环境工程调剂
已经有3人回复
-
283求调剂
已经有10人回复
-
290求调剂
已经有10人回复
-
321求调剂
已经有4人回复
-
326求调剂
已经有5人回复
-
东南大学364求调剂
已经有4人回复
-
085600材料与化工 求调剂
已经有13人回复
找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~
中国科学院化学研究所2012获83项 付红兵600万
已经有20人回复
- 【求助/交流】请教一个农杆菌转导的问题
已经有4人回复
点击这里搜索更多相关资源科研从小木虫开始，人人为我，我为人人
5