|
|
★ ★ ★ ★
805085868(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-10-22 13:35:30
首先生物信息学分析，主要涉及调控蛋白及对应结合部位的DNA
代谢调控的启动子结构分析
1)基因敲除, 突变子的筛选
2)调控蛋白的纯化
3)EMSA(Electroforetic Mobility Shift Analyses)实验鉴定调控蛋白的结合区:将纯化后的调控蛋白用不同的浓度与预测启动子DNA进行结合实验, 观察DNA的迁移率确定结合的区域。
4)对调控蛋白所调控的区域进行点突变:设计含有不同的突变点的引物, 通过overlap-extension PCR 得到含有突变的调控蛋白编码基因, 以及含有突变的启动子区域; 将突变后的蛋白克隆到表达载体上, 纯化后分别与启动子作用, 鉴定调控蛋白以及启动子的保守区域.
5)启动子区域的克隆以及启动子活性的分析：PCR扩增预测的启动子区域而得到不同区域的片段; 将其连接到含有报告基因lacZ 的无启动子载体上, 通过检测b-半乳糖苷酶活性来检测启动子的强弱。
6)确定转录起始位点:
7)RT-PCR确定调控蛋白调控的操纵子转录是否是一个转录单位 |
|
回复此楼
+1/473
