[交流] 有谁做过链霉菌抗生素基因簇里面的调控基因的，怎么研究啊，新手不大懂~~~

我这个调控基因是SARP调控基因，想根围绕这个基因做点东西，但是自己不知道怎么入手，能做哪些方面的工作啊？求高手指点。谢谢你们~~~~

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1楼 2012-10-20 19:26:58

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yandz680717

木虫 (正式写手)

应助: 14 (小学生)
金币: 4847.1
帖子: 683
在线: 345.6小时
虫号: 1160259

★ ★ ★ ★
805085868(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-10-22 13:35:30

首先生物信息学分析，主要涉及调控蛋白及对应结合部位的DNA
代谢调控的启动子结构分析
1)基因敲除, 突变子的筛选
2)调控蛋白的纯化
3)EMSA(Electroforetic Mobility Shift Analyses)实验鉴定调控蛋白的结合区:将纯化后的调控蛋白用不同的浓度与预测启动子DNA进行结合实验, 观察DNA的迁移率确定结合的区域。
4)对调控蛋白所调控的区域进行点突变:设计含有不同的突变点的引物, 通过overlap-extension PCR 得到含有突变的调控蛋白编码基因, 以及含有突变的启动子区域; 将突变后的蛋白克隆到表达载体上, 纯化后分别与启动子作用, 鉴定调控蛋白以及启动子的保守区域.
5)启动子区域的克隆以及启动子活性的分析：PCR扩增预测的启动子区域而得到不同区域的片段; 将其连接到含有报告基因lacZ 的无启动子载体上, 通过检测b-半乳糖苷酶活性来检测启动子的强弱。
6)确定转录起始位点:
7)RT-PCR确定调控蛋白调控的操纵子转录是否是一个转录单位

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2楼2012-10-21 09:09:50

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805085868

铁虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 75.4
帖子: 92
在线: 26.5小时
虫号: 1393000

引用回帖:

2楼: Originally posted by yandz680717 at 2012-10-21 09:09:50
首先生物信息学分析，主要涉及调控蛋白及对应结合部位的DNA
代谢调控的启动子结构分析
1)基因敲除, 突变子的筛选
2)调控蛋白的纯化
3)EMSA(Electroforetic Mobility Shift Analyses)实验鉴定调控蛋白的结合区:将 ...

谢谢你的回复。请问你做过EMSA实验吗？具体步骤怎样，有没有详细的步骤，能不能发一份给我，

实验室里面没有做过这个的，看原理挺简单的，不知道怎么入手。

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3楼2012-10-21 23:06:07

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