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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Klenow Fragment酶的用量问题
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phoebeww

铜虫 (小有名气)

[求助] Klenow Fragment酶的用量问题

我实验中需要用的这种酶，说明书中说到活性定义是”37℃30分钟内，催化10nmol dNTPs掺入到多聚核苷酸中所需要的酶量定义为一个活性单位“我现在要催化加入dNTPs的量是400nmol，应该加入的酶是多少U啊？
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1楼 2012-10-17 15:25:28
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361440594

木虫 (小有名气)

大神

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
phoebeww: 金币+2 2012-10-18 21:25:18
照你这个说明书上的计算，加入量不就是400÷10=40U吗？然后看看Klenow聚合酶的浓度是10U/微升，还是5U/微升，算出所加的聚合酶的量。
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Hero
2楼2012-10-17 21:51:16
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ycyyvonne

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
phoebeww: 金币+2 2012-10-18 21:24:08
是不是要用这么多哦，查下相关文献中用的是多少哟，我看到的有基本上有用10U的，我自己用过5U和2.5U，这个酶的活性还是比较高的
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3楼2012-10-18 08:29:29
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shixiaba

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-18 18:41:22
phoebeww: 金币+2 2012-10-18 21:27:19
理论上讲肯定是40单位37摄氏度30min内完全催化了。可是说明书上给的肯定是保守数据，而且楼主估计也是做检测分析的，自然没有必要用这么高的量。所以40单位是上限。
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4楼2012-10-18 09:05:32
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phoebeww

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ycyyvonne at 2012-10-18 08:29:29
是不是要用这么多哦，查下相关文献中用的是多少哟，我看到的有基本上有用10U的，我自己用过5U和2.5U，这个酶的活性还是比较高的

我也觉得这样计算下来咋这么多呢……有人说不应该按照催化加入dNTPs的量计算酶的用量我也不知道是这样不……
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5楼2012-10-18 21:25:05
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phoebeww

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 361440594 at 2012-10-17 21:51:16
照你这个说明书上的计算，加入量不就是400÷10=40U吗？然后看看Klenow聚合酶的浓度是10U/微升，还是5U/微升，算出所加的聚合酶的量。

这个我清楚，可是酶不是一般再需要过量5到10倍么……我买的酶也就是个100U啊
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6楼2012-10-18 21:26:08
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phoebeww

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shixiaba at 2012-10-18 09:05:32
理论上讲肯定是40单位37摄氏度30min内完全催化了。可是说明书上给的肯定是保守数据，而且楼主估计也是做检测分析的，自然没有必要用这么高的量。所以40单位是上限。

没有必要过量么？
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7楼2012-10-18 21:28:07
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shixiaba

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
phoebeww: 金币+2 2012-10-20 09:22:04
引用回帖:
7楼: Originally posted by phoebeww at 2012-10-18 21:28:07
没有必要过量么？...

我是做检测分析的，最近也正在做酶量的检测，按照这种思路肯定是不能过量啊。如果楼主是做别的应用需要完全催化，肯定那必然要过量了。40单位很多，不过根据自己底物的浓度，实际上用量不会太高的。
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8楼2012-10-19 09:08:12
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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phoebeww: 金币+2 2012-10-20 09:23:22
过量对实验有影响吗？
这个酶市面上买得挺便宜的了，而且一般都是删除了其外切酶活性的，所以我觉得过量点用以保证实验结果问题不大。
另外，在不同的反应体系中，受到不同因素的影响，酶的活力可能会有所不同，其活性单位可以做个参考，但若是严谨地进行操作，一般都是需要通过预实验后再确定的吧。
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小兵一个
9楼2012-10-19 09:42:42
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zijin999

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
10楼2014-12-14 18:51:37
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