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铜虫 (著名写手)

[求助] 高拷贝毕赤酵母表达出来的蛋白也是多拷贝的嘛还是自动酶切变成单体蛋白了

大家好,我想请教一下,高拷贝毕赤酵母表达出来的蛋白也是多拷贝的嘛还是自动酶切变成单体蛋白了?
因为我的蛋白是25KD左右但诱导出来的蛋白是66-110KD之间
不知道是不是我要的
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475502411

铜虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by maychao123 at 2012-10-14 21:43:19
还送我花呢,谢谢啊  这次帮你回答问题我也学到了不少关于酵母表达系统的知识。
我还想问一下,你是怎么确定你的菌在基因组上形成高拷贝了,测序了么?

没有,是在G418筛选的,他在1mg/ml的板上可以长,并且做PCR的时候有目的条带和2倍目的条带的
这样可以吗?
基因组可以测序吗?
谢谢
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
7楼2012-10-19 08:55:49
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maychao123

银虫 (小有名气)

一般串连的高拷贝系统表达出来的蛋白不会融合到一起吧,你是按文献的方法做的么?每一段目的基因前面都有加核糖体结合位点么?
Don‘tforget3Oct
2楼2012-10-12 15:32:47
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475502411

铜虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by maychao123 at 2012-10-12 15:32:47
一般串连的高拷贝系统表达出来的蛋白不会融合到一起吧,你是按文献的方法做的么?每一段目的基因前面都有加核糖体结合位点么?

是按我们论坛上的操作手册做的,没有加。
我是直接把目的基因双酶切连接到PIC3.5K和PIC9K的载体上,线性化完直接转,然后诱导。
是不是做的有问题呢?
谢谢
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
3楼2012-10-12 17:45:15
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maychao123

银虫 (小有名气)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-15 13:40:05
我主要做的是原核表达,刚看了下你说的这两个质粒都是自带核糖体结合位点的,这样就算是在基因组上形成了高拷贝也不会造成蛋白融合的问题,应该是单体,更何况你的质粒上还带有终止区域,所以问题肯定不是因为高拷贝数造成的。http://www.dxy.cn/bbs/topic/6015595  这个不知道你看没看过,里面主要提到两个问题,一个是转化子筛选的问题,还一个是转化方法的问题,希望对你有帮助。另外你确定66-110KD之间的那个条带是诱导产物么?
Don‘tforget3Oct
4楼2012-10-13 17:00:51
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