应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上
52/1返回列表
查看: 3652  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

connieba

新虫 (小有名气)

[求助] 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上

做了很多次了，大小2.7kb的目的基因一直连不上pEASY-E1载体。感受态和载体确定都没有问题，步骤也完全按照说明书上的做的。转化Trans-T1感受态后涂Amp平板，能长出单菌落，但是挑取单菌落做菌落PCR都呈阴性。实在是找不到原因了，望好心人帮助~是实验手法的问题吗？之前也做过连接1.8Kb目的基因的，很顺利的就连上了~
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-09-21 11:01:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hmily890404

新虫 (小有名气)
我用的他们公司的pEASY-Blunt Simple，也是连了好几次连不上！！之前一连就连上了！求助！！
赞一下 回复此楼
11楼2015-03-25 14:48:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-21 14:26:39
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗？是的话先确保A尾。2.7K有些大了，其他都没有问题的话，试下延长连接时间，过夜较好，并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行，就换载体，推荐Promega的pGEM-T，我3.6K多的基因一连一个准。有时候选择贵一点的东西是没错的，不要贪图便宜方便。
       个人看法 若有说错请高手指点
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
2楼2012-09-21 13:52:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

connieba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 13:52:28
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗？是的话先确保A尾。2.7K有些大了，其他都没有问题的话，试下延长连接时间，过夜较好，并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行，就换载体，推荐Pro ...

是载体哦，这个是买的全式金的试剂盒，连接速度比较快的，只要二十分钟就可以了，我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的，直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的，都没问题。
我是新手，请多指教~
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-21 14:02:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by connieba at 2012-09-21 14:02:47
是载体哦，这个是买的全式金的试剂盒，连接速度比较快的，只要二十分钟就可以了，我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的，直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的，都没问题。
我是新手，请多指 ...

嗯...............
       ？为什么要液体回收，胶回收才对吧，液体中肯定有小分子量杂条带，会与大分子量条带竞争，就是胶回收都有这样的问题。30分钟对于3kb的条带太吃力了，如果试剂盒里边连接酶是T4的话，还是推荐过夜连接。
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2012-09-21 15:27:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 E4V9bALS54sj 2026-09-19 4/200 2026-09-20 07:24 by 9i7PCSZyMzot
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 E4V9bALS54sj 2026-09-19 4/200 2026-09-20 07:24 by 9i7PCSZyMzot
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 E4V9bALS54sj 2026-09-19 4/200 2026-09-20 07:12 by 9i7PCSZyMzot
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 E4V9bALS54sj 2026-09-19 4/200 2026-09-20 07:01 by 9i7PCSZyMzot
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 E4V9bALS54sj 2026-09-19 4/200 2026-09-20 07:01 by 9i7PCSZyMzot
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 E4V9bALS54sj 2026-09-19 4/200 2026-09-20 06:55 by 9i7PCSZyMzot
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 3/150 2026-09-20 00:15 by 9i7PCSZyMzot
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 3/150 2026-09-20 00:03 by 9i7PCSZyMzot
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 4/200 2026-09-20 00:03 by 9i7PCSZyMzot
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 4/200 2026-09-19 23:51 by 9i7PCSZyMzot
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 4/200 2026-09-19 23:39 by 9i7PCSZyMzot
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 4/200 2026-09-19 23:27 by 9i7PCSZyMzot
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 4/200 2026-09-19 23:03 by 9i7PCSZyMzot
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-19 4/200 2026-09-19 23:03 by 9i7PCSZyMzot
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 4pRyVGCVerAA 2026-09-18 7/350 2026-09-19 21:03 by 9i7PCSZyMzot
[教师之家] 现代”学阀”该如何界定 +3 iaeyuan 2026-09-19 3/150 2026-09-19 20:52 by 没昵称呀
[基金申请] 国社科系统bug了，是不是要放榜了？ +7 kynobel 2026-09-16 9/450 2026-09-19 14:52 by 接好运婷
[考博] 申博发邮件 +8 Lmengk 2026-09-15 9/450 2026-09-19 09:27 by 中间体超市
[有机交流] 各位大神，目前国内有哪些比较好用的逆合成软件？ 20+3 zapen 2026-09-15 9/450 2026-09-18 18:17 by zapen
[考博] 上海工程技术大学激光智能制造课题组｜2027级博士研究生招生公告 +7 水士口 2026-09-16 8/400 2026-09-16 13:47 by kkklens
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭