应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-基因的突变文库相关问题
81/1返回列表
查看: 2028  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wujibifan

新虫 (小有名气)

[求助] 求助-基因的突变文库相关问题 已有1人参与

给位大侠，小弟最近在构建一个基因的突变文库，具体流程是：先克隆该基因，连到一个穿梭载体上，测序确定该基因后，进行易错PCR，来得到该基因的突变体，然后和之前同样的载体连接，转化大肠杆菌，进而构建突变文库。
现遇到的问题：转化率太低，每次转化就长几个菌，导致文库的容量不够，没有代笔性。
求助：请各位大侠帮帮我，我该在那些地方改进呢？我已验证酶切效果很好，转化过程中设置了阳性对照，转化也很好，估计是连接过程出问题？目的片段与载体的摩尔比很重要吗？用哪个公司的连接酶效果会好些？我用过TAKARA，Promega的，效果都差不多。缓冲液失效了？

[ Last edited by 1949stone on 2012-9-13 at 07:43 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-12 14:25:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般DNA片段和质粒用的摩尔比是3:1.载体为什么要用穿梭载体呢？
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-13 00:18:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收片段测定DNA浓度 可以做一个不同比例浓度的连接比较  我以前连接转化长的满满的，阳性90%, 用的是fermentals。感受态可能也比较重要，感觉某些公司的还不如自己做的效率高。
赞一下 回复此楼
仕不可不弘毅，任重而道远
3楼2012-09-13 14:26:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wujibifan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 00:18:09
一般DNA片段和质粒用的摩尔比是3:1.载体为什么要用穿梭载体呢？

现在大肠里扩增质粒，然后提出质粒在转到表达系统酿酒酵母里。
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-19 20:18:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wujibifan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-09-13 14:26:15
回收片段测定DNA浓度 可以做一个不同比例浓度的连接比较  我以前连接转化长的满满的，阳性90%, 用的是fermentals。感受态可能也比较重要，感觉某些公司的还不如自己做的效率高。

我一般都是跑电泳目测DNA的浓度，我目的片段的浓度大概20~30ng/ul，大小700多，质粒浓度50ng/ul, 大小6kb，所以我采用加6微升的目的片段，2微升的质粒，最近做了16度连接过夜，效果比以前好多了，200微升的转化液体能长70个菌落，你说这样的效率高还是低？
赞一下 回复此楼
5楼2012-09-19 20:21:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wujibifan at 2012-09-19 20:21:50
我一般都是跑电泳目测DNA的浓度，我目的片段的浓度大概20~30ng/ul，大小700多，质粒浓度50ng/ul, 大小6kb，所以我采用加6微升的目的片段，2微升的质粒，最近做了16度连接过夜，效果比以前好多了，200微升的转化液体 ...

效率太低 还得再优化 可以比较下不同公司的T4  长的满满才行 70文库量太小
赞一下 回复此楼
仕不可不弘毅，任重而道远
6楼2012-09-20 09:05:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zdty

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，你的文库容量是怎么计算的？求交流。。。
赞一下 回复此楼
7楼2013-10-15 22:16:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

melindag

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主，你用的是什么转化方法？如果是热击法，是否换一下电击法，转化率会高一点？如果不是，你优化一下转化条件会不会好一点。

另外，我也将做易错PCR，请问楼主，你的库容量是如何计算的？是就只看转化过后，涂布平板的菌株生长情况么？易错过后的产物全部回收、全部转化？
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-13 21:12:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wujibifan 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:23 by Xc2FxHsHkBNc
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 4/200 2026-11-07 16:50 by Xc2FxHsHkBNc
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 4/200 2026-11-07 16:28 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 4/200 2026-11-07 10:14 by byEJ59EAM6hR
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 14/700 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:23 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 10/500 2026-11-06 12:32 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 09:01 by 2lRNluKrJpwL
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 11/550 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-06 01:51 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:42 by qL1cU46YIdK0
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-05 11:10 by PYZmcHr5kSaq
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭