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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-基因的突变文库相关问题
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wujibifan

新虫 (小有名气)

[求助] 求助-基因的突变文库相关问题 已有1人参与

给位大侠，小弟最近在构建一个基因的突变文库，具体流程是：先克隆该基因，连到一个穿梭载体上，测序确定该基因后，进行易错PCR，来得到该基因的突变体，然后和之前同样的载体连接，转化大肠杆菌，进而构建突变文库。
现遇到的问题：转化率太低，每次转化就长几个菌，导致文库的容量不够，没有代笔性。
求助：请各位大侠帮帮我，我该在那些地方改进呢？我已验证酶切效果很好，转化过程中设置了阳性对照，转化也很好，估计是连接过程出问题？目的片段与载体的摩尔比很重要吗？用哪个公司的连接酶效果会好些？我用过TAKARA，Promega的，效果都差不多。缓冲液失效了？

[ Last edited by 1949stone on 2012-9-13 at 07:43 ]
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1楼 2012-09-12 14:25:53
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般DNA片段和质粒用的摩尔比是3:1.载体为什么要用穿梭载体呢？
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2楼2012-09-13 00:18:09
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收片段测定DNA浓度 可以做一个不同比例浓度的连接比较  我以前连接转化长的满满的，阳性90%, 用的是fermentals。感受态可能也比较重要，感觉某些公司的还不如自己做的效率高。
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仕不可不弘毅，任重而道远
3楼2012-09-13 14:26:15
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wujibifan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 00:18:09
一般DNA片段和质粒用的摩尔比是3:1.载体为什么要用穿梭载体呢？

现在大肠里扩增质粒，然后提出质粒在转到表达系统酿酒酵母里。
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4楼2012-09-19 20:18:31
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wujibifan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-09-13 14:26:15
回收片段测定DNA浓度 可以做一个不同比例浓度的连接比较  我以前连接转化长的满满的，阳性90%, 用的是fermentals。感受态可能也比较重要，感觉某些公司的还不如自己做的效率高。

我一般都是跑电泳目测DNA的浓度，我目的片段的浓度大概20~30ng/ul，大小700多，质粒浓度50ng/ul, 大小6kb，所以我采用加6微升的目的片段，2微升的质粒，最近做了16度连接过夜，效果比以前好多了，200微升的转化液体能长70个菌落，你说这样的效率高还是低？
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5楼2012-09-19 20:21:50
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wujibifan at 2012-09-19 20:21:50
我一般都是跑电泳目测DNA的浓度，我目的片段的浓度大概20~30ng/ul，大小700多，质粒浓度50ng/ul, 大小6kb，所以我采用加6微升的目的片段，2微升的质粒，最近做了16度连接过夜，效果比以前好多了，200微升的转化液体 ...

效率太低 还得再优化 可以比较下不同公司的T4  长的满满才行 70文库量太小
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仕不可不弘毅，任重而道远
6楼2012-09-20 09:05:39
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zdty

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，你的文库容量是怎么计算的？求交流。。。
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7楼2013-10-15 22:16:32
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melindag

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主，你用的是什么转化方法？如果是热击法，是否换一下电击法，转化率会高一点？如果不是，你优化一下转化条件会不会好一点。

另外，我也将做易错PCR，请问楼主，你的库容量是如何计算的？是就只看转化过后，涂布平板的菌株生长情况么？易错过后的产物全部回收、全部转化？
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8楼2014-05-13 21:12:58
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