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wujibifan

新虫 (小有名气)

[求助] 求助-基因的突变文库相关问题已有1人参与

给位大侠,小弟最近在构建一个基因的突变文库,具体流程是:先克隆该基因,连到一个穿梭载体上,测序确定该基因后,进行易错PCR,来得到该基因的突变体,然后和之前同样的载体连接,转化大肠杆菌,进而构建突变文库。
现遇到的问题:转化率太低,每次转化就长几个菌,导致文库的容量不够,没有代笔性。
求助:请各位大侠帮帮我,我该在那些地方改进呢?我已验证酶切效果很好,转化过程中设置了阳性对照,转化也很好,估计是连接过程出问题?目的片段与载体的摩尔比很重要吗?用哪个公司的连接酶效果会好些?我用过TAKARA,Promega的,效果都差不多。缓冲液失效了?

[ Last edited by 1949stone on 2012-9-13 at 07:43 ]
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般DNA片段和质粒用的摩尔比是3:1.载体为什么要用穿梭载体呢?
2楼2012-09-13 00:18:09
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
回收片段测定DNA浓度 可以做一个不同比例浓度的连接比较  我以前连接转化长的满满的,阳性90%, 用的是fermentals。感受态可能也比较重要,感觉某些公司的还不如自己做的效率高。
仕不可不弘毅,任重而道远
3楼2012-09-13 14:26:15
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wujibifan

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-13 00:18:09
一般DNA片段和质粒用的摩尔比是3:1.载体为什么要用穿梭载体呢?

现在大肠里扩增质粒,然后提出质粒在转到表达系统酿酒酵母里。
4楼2012-09-19 20:18:31
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wujibifan

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 墨香若水 at 2012-09-13 14:26:15
回收片段测定DNA浓度 可以做一个不同比例浓度的连接比较  我以前连接转化长的满满的,阳性90%, 用的是fermentals。感受态可能也比较重要,感觉某些公司的还不如自己做的效率高。

我一般都是跑电泳目测DNA的浓度,我目的片段的浓度大概20~30ng/ul,大小700多,质粒浓度50ng/ul, 大小6kb,所以我采用加6微升的目的片段,2微升的质粒,最近做了16度连接过夜,效果比以前好多了,200微升的转化液体能长70个菌落,你说这样的效率高还是低?
5楼2012-09-19 20:21:50
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wujibifan at 2012-09-19 20:21:50
我一般都是跑电泳目测DNA的浓度,我目的片段的浓度大概20~30ng/ul,大小700多,质粒浓度50ng/ul, 大小6kb,所以我采用加6微升的目的片段,2微升的质粒,最近做了16度连接过夜,效果比以前好多了,200微升的转化液体 ...

效率太低 还得再优化 可以比较下不同公司的T4  长的满满才行 70文库量太小
仕不可不弘毅,任重而道远
6楼2012-09-20 09:05:39
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zdty

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主,你的文库容量是怎么计算的?求交流。。。
7楼2013-10-15 22:16:32
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melindag

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

请问楼主,你用的是什么转化方法?如果是热击法,是否换一下电击法,转化率会高一点?如果不是,你优化一下转化条件会不会好一点。

另外,我也将做易错PCR,请问楼主,你的库容量是如何计算的?是就只看转化过后,涂布平板的菌株生长情况么?易错过后的产物全部回收、全部转化?
8楼2014-05-13 21:12:58
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