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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

[求助] 几丁质酶测酶活的方法 已有1人参与

小弟在测几丁质酶的酶活,是筛选得到的菌株进行摇瓶发酵后测酶活。
发酵培养基只含有几丁质和一些无机矿物离子,发酵三天后测活。
采用DNS法,1mg/ml的葡萄糖做标准曲线。

问题是:1)阳性对照也没有活性
2)分别对发酵液上清、粗酶液、胞内蛋白进行测活,均没有活性

附测活方法:取上清,加入缓冲液,再加入胶体几丁质,然后45度水浴过夜反应,之后终止反应,测活。以灭火的酶液做对照。

希望高手解答!谢谢!
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well_想太多

新虫 (小有名气)

引用回帖:
20楼: Originally posted by 麦子绿豆 at 2014-03-01 12:55:39
85% 浓磷酸 这种方法比用乙醇好一些...

楼主,我看文献里没有提及浓磷酸的具体用量,及最后加蒸馏水的量,请问和浓盐酸时一样的吗?还有请问您开始时用丙酮研磨了吗?我做出来的就是还是颗粒明显,静置时会分层,倒平板也不是均匀分散在水中,焦虑死了,万分感谢您的帮助!
22楼2014-03-03 22:22:21
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
麦子绿豆: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-11 10:47:39
你确定你发酵之后得到了你要的菌株了 ?做个镜检试试 和你接种的微生物进行对比 看是不是你要的菌株 ,也有可能该微生物没有表达这种酶  ,我们基本都不这么做 如果确定这个微生物产几丁质酶的话 那都是提DNA 测序  然后转大肠杆菌发酵  这种技术比较成熟点
ControlMyself
2楼2012-09-10 16:48:54
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麦子绿豆

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2012-09-10 16:48:54
你确定你发酵之后得到了你要的菌株了 ?做个镜检试试 和你接种的微生物进行对比 看是不是你要的菌株 ,也有可能该微生物没有表达这种酶  ,我们基本都不这么做 如果确定这个微生物产几丁质酶的话 那都是提DNA 测序  ...

谢谢!但是目前我是想先测得一株酶活较高的再去测序,鉴定。是测酶活这里卡住了,不过即使你说的方法,最后也是需要测酶活的吧~但我也准备尝试一下,谢谢!
3楼2012-09-11 10:47:20
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num20062622

银虫 (正式写手)

楼主 我也要测酶活..
但是不是测几丁质酶
是测纤维素酶活
跟果胶酶活性
也是用DNS法。
但是目前我还不是太会
希望楼主能跟我联系 求交流...
可以么 楼主..
4楼2012-09-11 17:43:45
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