| 查看: 11799 | 回复: 79 | ||
| 本帖产生 1 个 MicEPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
lovestrings金虫 (小有名气)
|
[求助]
扫描电镜样品前处理
|
|
|
小女子做的是弧菌的电镜实验，曾经做过一次，按照下面的步骤做的，但是效果不好，细菌拍下来不立体。 将菌液以3000r /min转速离心10min后，弃上清液。注入 2.5%戊二醛，静置2h以上固定。固定后离心，将细菌沉积，弃上清，以蒸馏水重悬浮，重复3次，最后以蒸馏水重悬。分别用30%、50 %、70 %、80%、90%梯度浓度酒精脱水，每个梯度中静置 10min，脱水完毕，用纯酒精脱水 3次，每次30min，然后用纯叔丁醇置换酒精3次, 每次30min，最后吸取混匀的细菌-叔丁醇悬浮液滴在覆有盖玻片的样品台上，置冷冻干燥机内真空干燥。 有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？ |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
苹果菠萝» 猜你喜欢
国自然面上和省基金B类撒花
已经有4人回复
-
华师大读博
已经有3人回复
-
急需审稿人！！！
已经有3人回复
-
申博/考博
已经有8人回复
-
一志愿A区211，22408 321求调剂
已经有8人回复
-
295分求调剂
已经有6人回复
-
一志愿中科大材料与化工，353分还有调剂学校吗
已经有13人回复
-
085600材料与化工调剂
已经有6人回复
-
期刊推荐
已经有5人回复
-
有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业
已经有7人回复
22楼2012-12-10 16:37:33
416114799
至尊木虫 (知名作家)
- MicEPI: 2
- 应助: 707 (博后)
- 金币: 14775.5
- 散金: 1799
- 红花: 150
- 帖子: 9935
- 在线: 1607.4小时
- 虫号: 996663
- 注册: 2010-04-14
- 专业: 环境微生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, MicEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-09-03 20:47:20
lovestrings: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 实在感谢了~~ 2012-09-04 15:44:39
小木虫: 金币+2, 帖子真精彩 2015-04-01 16:44:25
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+6, MicEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-09-03 20:47:20
lovestrings: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 实在感谢了~~ 2012-09-04 15:44:39
小木虫: 金币+2, 帖子真精彩 2015-04-01 16:44:25
|
按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h→磷酸缓冲液洗涤 3 次→乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）→ 乙酸异戊酯置换乙醇 2 次（20 min/次），每一步完成后经 8000 r/min 离心 5 min。将样品分别在 20℃、40℃和80℃冷冻 12 h，于冷冻干燥仪中干燥 12 h，备用。 我是这么做的。根据你的描述，有以下问题：①戊二醛固定时间不够；②洗涤液不能用水，必须用磷酸缓冲液PBS（1/15 mol/L，pH=7.2；配方：Na2HPO4*12H2O取23.876g+KH2PO4取9.078g，分别溶于1 L水中，然后将二者按照7:3的体积比混合（V:V），就可以了。）；③不知道你的戊二醛是怎么配的？戊二醛应该用以上的PBS来配置；④酒精梯度脱水，顾名思义就是要把水自由水除去，但是如果不按梯度，突然用100%来脱水是不行的，因为浓度太高，细胞形态就严重变形；按照我的这个梯度，我做出来非常漂亮；⑤ 在冷冻干燥前，必须把脱去自由水的样品按照从-20→-40→-80的梯度冷冻，目的把结合水固定住，梯度原理与④相同；⑥ 乙酸异戊酯的目的是置换掉乙醇，该药品神经毒，请在通风橱进行，不过只是有机物而已，偶尔接触没关系，不用怕。凡药品都有毒的。无法附图片，不然给你看看我拍的。希望对你有帮助。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
3楼2012-09-03 20:18:12
416114799
至尊木虫 (知名作家)
- MicEPI: 2
- 应助: 707 (博后)
- 金币: 14775.5
- 散金: 1799
- 红花: 150
- 帖子: 9935
- 在线: 1607.4小时
- 虫号: 996663
- 注册: 2010-04-14
- 专业: 环境微生物学
4楼2012-09-03 20:21:11
416114799
至尊木虫 (知名作家)
- MicEPI: 2
- 应助: 707 (博后)
- 金币: 14775.5
- 散金: 1799
- 红花: 150
- 帖子: 9935
- 在线: 1607.4小时
- 虫号: 996663
- 注册: 2010-04-14
- 专业: 环境微生物学
5楼2012-09-03 22:54:04
5