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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

[求助] 【求助】急~~测序发现在引物位置发现一个碱基缺失

表达一个蛋白,高保真酶PCR后克隆到载体上用载体引物测序,单向测完一个反应后发现在引物中间位置有一个碱基缺失,请问这是什么原因?是引物有问题还是测序的问题?是否需要双向测通?我现在还有一个克隆,对它进行测序能够得到正确结果吗?现在需要表达的结果发文章毕业,真是急死人了
上峰图,箭头位置为缺失位置

测序峰图
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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liuyu_sdili: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢啦 2012-08-29 18:00:45
从峰图上来看,是没有问题的,请问你这个位置在峰图上是多少位,前几十bp和七百以后有可能不准,可以双向测序确定下,另外多挑取几个单克隆测序看看
生物化学与分子生物学
14楼2012-08-27 10:19:18
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haozi1989

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+2, 有帮助 2012-08-26 09:07:20
看峰图 测序应该没问题。。换家公司测序试试。我们实验室出个引物给合成错误的现象。 你问下你的引物合成公司
很多我们以为一辈子都不会忘记的事情,就在我们念念不忘的日子里,被我们遗忘了....
2楼2012-08-25 18:17:21
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuyu_sdili: 金币+1, 有帮助 2012-08-26 09:07:52
对测序又疑问的时候,最好的办法是:尽量多测一些序列,全部两端测序。这样才有说服力。仅仅一个序列没有统计规律,无法说清具体是测序问题,还是扩增问题。。。。。。
3楼2012-08-25 21:55:55
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jjg0912

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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liuyu_sdili: 金币+2, 有帮助 2012-08-26 09:05:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-27 13:45:01
对于一个载体构建,我一般都挑4个单克隆用10微升水稀释,一半作菌落PCR。一般转移到一个平板上生长。然后根据PCR结果,提取质粒。一般我每次送两个质粒出去测序,而且一般都是双向测序,这样比较稳妥。一般每次都能拿到一个理想的结果,虽然费点钱,可是节约了时间,提高了效率,感觉还蛮好的。
4楼2012-08-26 06:16:20
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