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jonsen

铁虫 (初入文坛)

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专业: 水产生物免疫学与病害控制

[求助] 通过温敏质粒构建链球菌基因缺失

请求研究相关方向的前辈帮助:
      小弟去年开始做链球菌基因敲出试验的,使用的是温敏穿梭载体,通过融合PCR将上游同源臂(1000bp),抗性基因(CAT),下游同源臂(800bp)连在一起,电转化后按照之前的文献报道的氯霉素抗性浓度进行筛选,具体筛选方式如下:
1,通过28度+穿梭载体上抗性基因的抗生素,肉汤里传代2次;
2,通过37度+穿梭载体上抗性基因的抗生素,肉汤里传代3次;
3,通过28度+不加任何抗生素,肉汤里传代5次;
4,将无抗传代5次的菌液普于含氯霉素(5μg/ml)的抗性平板上,28度培养两天;
   这个方法是参考外文里的方法做的,但是我做了将近两个月还是没有在氯霉素平板上看见什么长出,不知道方法有没有问题,恳请研究相关方向的前辈指点.
      还有就是我的氯霉素抗性基因是660bp,刚好是cat的CDS区,我之前看其他人用其他载体做缺失时都在抗性基因前面加入了一个启动子,不知道这个有没有影响.对于做缺失是不是一定要加启动子或者在那种情况下架启动子,我很茫然,希望各位前辈能提供宝贵意见!

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