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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

最近在构建一个载体。载体用的是PET-28a,目的片段680bp。酶切位点是BamHI和HindIIII。连接了两次都长了20个左右的菌落,其中一次做了阴性对照和感受态对照,结果只有转化连接产物的长了,但PCR和酶切鉴定都没有,拿去测序中间连了未知的东西。做了两周了,好急啊,请高手指点!


另外也同时连了PET-TrX、GST、DsbA、His,结果是一样的,每次转化后都有菌落长出来,但是就是鉴定不出来我自己的目的片段,好郁闷
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可以朝九晚五,也能浪迹天涯
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cmin126

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by luckyforus66 at 2012-08-01 16:02:59
实验室其他人用电转化时出过类似的问题,貌似用普通转化(热激转化)好一些。

我也出现了类似问题,目的片段是PCR产物,从基因组DNA P下来的。长的菌落很少,鉴定也都为假阳性,求教啊
13楼2012-08-04 20:48:14
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luckyforus66

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


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475502411: 金币+1 2012-08-04 14:31:56
实验室其他人用电转化时出过类似的问题,貌似用普通转化(热激转化)好一些。
2楼2012-08-01 16:02:59
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-01 20:56:28
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:10
做过相似的载体构建,用的是热激转化。遇到这种情况,先分析你的目的片段。是来源于载体还是直接的PCR产物?先确认酶切位点没有问题,双酶切回收的片段是很好链接的。再做一个对照,确认感受态和连接酶没有问题。
3楼2012-08-01 20:44:48
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-02 15:25:19
475502411: 金币+1 2012-08-04 14:32:19
听起来你的克隆本身没有问题,你的对照还是很全的。我个人觉得你可以考虑将你的PCR产物直接测序看看,是否是你需要的片段。
4楼2012-08-01 23:07:10
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