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wuyuan1992金虫 (正式写手)
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[求助]
为什么做PCR时候模板浓度高了会扩增不出目的片段？
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在做真菌ITS序列扩增鉴定种属的时候，师兄让我将总DNA梯度稀释，分别取原液、稀释十倍、稀释一百倍的总DNA作为模板进行PCR扩增。因为凭师兄的经验而谈，有时候可能总DNA浓度太高会导致扩增不出，一次性梯度稀释扩增出目的产物的可能性会很高。 我想问的问题是： 1、为什么总DNA浓度高作为模板会导致扩增不出东西？ 2、PCR时对于模板的浓度有什么规定么？ 希望各位虫友能够帮忙解答，在此谢过～  |
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我最近也在做这个 做了三四次都是做不出来 稀释了浓度就跑出来了 刚开始还以为DNA降解了 所以特别过来求原理
12楼2014-12-01 12:30:50
cynthia8225
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2楼2012-07-25 14:41:29
starseacow
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
wuyuan1992: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 非常感谢！我感觉很有道理～ 2012-07-26 07:45:19
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wuyuan1992: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 非常感谢！我感觉很有道理～ 2012-07-26 07:45:19
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同意楼上提的几条 我考虑还有其他原因，如下 1 模板浓度过高，在退火时模板会和引物竞争，模板与模板互相结合 2 在前几轮PCR反应中，引物只是不断反复和模板结合，和产物结合较少 3 模板浓度过高，最终电泳时会有条带弥散 至于最佳浓度，参考分子克隆实验指南的说法，用哺乳动物基因组DNA做模板时，每个PCR反应所加入DNA约为1 微克，而酵母，细菌与质粒DNA作为模板时，典型模板量应为10 ng，1 ng和1 pg |
3楼2012-07-26 00:06:10
215421160
金虫 (初入文坛)
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4楼2012-07-26 02:40:24