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chgoahead

新虫 (初入文坛)

[交流] pKD46 已有4人参与

我在做Red敲除，将pKD46电转入克雷伯氏菌中，点转之前对pKD46进行了PCR验证，有那三个功能基因，PCR产物大概1900多。但是转入克雷伯氏菌后，再提质粒进行PCR验证就没有1900的目的条带了，没有任何条带。电转前后质粒的电泳条带是一样高的
。我很困惑，不知道问题出在哪了？望虫友多多支招
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xuxib

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1楼 2012-07-21 20:39:43
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你确定pKD46这个质粒转入菌中了吗？pKD46是氨苄青霉素抗性，原始菌必须不能有氨苄青霉素抗性才行，这样才能筛选。另外，有时候可能是假阳性。
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好孩子！
2楼2012-07-21 22:52:45
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2008116068

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
pKD46，我做转化倒没遇到什么问题，但是老是重组不上
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只要踮起脚尖，就离太阳更近一点！！！
3楼2012-07-22 10:21:49
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chgoahead

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-07-21 22:52:45
你确定pKD46这个质粒转入菌中了吗？pKD46是氨苄青霉素抗性，原始菌必须不能有氨苄青霉素抗性才行，这样才能筛选。另外，有时候可能是假阳性。

嗯，转进去了。提出来的质粒大小一样。克雷伯氏菌具有氨苄抗性，但是当氨苄浓度达到300mg/ml时，克雷伯氏菌就不能生长了，所以我筛选转化子的氨苄浓度为300mg/ml。
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4楼2012-07-22 10:22:58
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chgoahead

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 2008116068 at 2012-07-22 10:21:49
pKD46，我做转化倒没遇到什么问题，但是老是重组不上

转进去后，你对已转进的pKD46做PCR验证了吗
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5楼2012-07-22 14:07:46
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2008116068

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by chgoahead at 2012-07-22 14:07:46
转进去后，你对已转进的pKD46做PCR验证了吗...

做过抗性验证，pcr验证没做过
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只要踮起脚尖，就离太阳更近一点！！！
6楼2012-07-24 12:03:10
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灰血动物

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问你使用氨苄浓度是i多少？
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未完成
7楼2012-07-31 20:46:49
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chgoahead

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 灰血动物 at 2012-07-31 20:46:49
请问你使用氨苄浓度是i多少？

是100ug/mL的
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8楼2012-09-04 09:51:31
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xuxib

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
求敲除质粒
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9楼2013-05-16 11:00:25
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