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chgoahead

新虫 (初入文坛)

[交流] pKD46 已有4人参与

我在做Red敲除,将pKD46电转入克雷伯氏菌中,点转之前对pKD46进行了PCR验证,有那三个功能基因,PCR产物大概1900多。但是转入克雷伯氏菌后,再提质粒进行PCR验证就没有1900的目的条带了,没有任何条带。电转前后质粒的电泳条带是一样高的
。我很困惑,不知道问题出在哪了?望虫友多多支招
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chgoahead

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 灰血动物 at 2012-07-31 20:46:49
请问你使用氨苄浓度是i多少?

是100ug/mL的
8楼2012-09-04 09:51:31
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你确定pKD46这个质粒转入菌中了吗?pKD46是氨苄青霉素抗性,原始菌必须不能有氨苄青霉素抗性才行,这样才能筛选。另外,有时候可能是假阳性。
好孩子!
2楼2012-07-21 22:52:45
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2008116068

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
pKD46,我做转化倒没遇到什么问题,但是老是重组不上
只要踮起脚尖,就离太阳更近一点!!!
3楼2012-07-22 10:21:49
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chgoahead

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-07-21 22:52:45
你确定pKD46这个质粒转入菌中了吗?pKD46是氨苄青霉素抗性,原始菌必须不能有氨苄青霉素抗性才行,这样才能筛选。另外,有时候可能是假阳性。

嗯,转进去了。提出来的质粒大小一样。克雷伯氏菌具有氨苄抗性,但是当氨苄浓度达到300mg/ml时,克雷伯氏菌就不能生长了,所以我筛选转化子的氨苄浓度为300mg/ml。
4楼2012-07-22 10:22:58
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