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16S rDNA测序问题已有2人参与
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各位前辈，我想请教一下16S rDNA测序问题。我要鉴定一个未知菌，用试剂盒提基因组DNA，然后用通用引物PCR，在1500bp处有很亮的条带，又将PCR产物割胶纯化，然后送去测序，测了两次都没测通。测序公司给了我一下三个可能性。 1.已纯化的PCR样品造成这种情况的原因是由于模板纯化有一定问题，模板中含有非特异性的条带； 2.如果是未纯化的PCR产物，那么有可能是您要求测序的片段周围含有大小相近的条带，我们通过琼脂糖凝胶回收，无法有效切除这种大小差别不是很明显的条带； 3.模板或是引物质量较差，测序反应结束之后没有产生足够的目的产物，导致测序信号较弱，杂背景较高，形成重叠现象。 我看了一些文献，好多就是直接把PCR产物测序，我这个也有条带啊，怎么就测不出来呢？我怀疑是我的菌不够纯，都划线6次以上了。请各位前辈们看看我这问题出在哪里了？ 还有，对于鉴定菌我一直迷茫是先做生理生化鉴定还是先做16S鉴定，做生理生化鉴定我不知道该做哪些指标。。。 |
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