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琼脂糖凝胶电泳的拖尾问题~~~ 已有1人参与
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做了几次琼脂糖凝胶电泳，根据文献的条件做的，可就是重复不出来，严重拖尾，换了新电泳缓冲液，重新配制胶等方法都试过了，可就是不行~~~ 上图 大侠们帮忙分析分析吧，都做了太多次了，找不出原因呢~~~  电泳成像图 |
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【答案】应助回帖
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1. PCR产物出现拖尾的因素有很多，总结为一条，就是非特异性扩增过多。原因可能是： （1） 模板不纯：纯化模板 （2） Buffer不合适：更换Buffer （3） 退火温度偏低：适当提高退火温度 （4） 酶量过多：适量用酶，或调换另一种酶 （5） dNTP、Mg2+浓度偏高：适当降低dNTP和镁离子的浓度 （6） 循环次数过多：减少循环次数 （7） 模板量少或引物量过多：增加模板量，减少引物的用量 2. 提质粒的时候经常有这种个现象，有可能是样品浓度过高了。这种情况简单，稀释一下就行了。 3. 提基因组DNA的时候也常出现拖尾，最可能的就是提的DNA中掺杂有蛋白质，蛋白质会拽DNA的泳动。所以一定要注意提取基因的操作，减少蛋白质等杂质的出现。 4. 样品破碎或是被降解 5. 存在RNA：DNA前面的一片一般都是未清除的RNA，经过纯化，RNAse处理，就没有了 6. 电泳体系的问题：观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照 （1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染：。建议更换缓冲液。 （2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。 （3）电压太高：适当降低电压 （4）根据核酸片断大小，适当把加大凝胶浓度。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%, 分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。英格恩 |
12楼2015-09-21 16:52:38
2楼2012-07-18 20:02:56
3楼2012-07-19 11:27:13
linchenyu
铁虫 (小有名气)
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- 帖子: 65
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- 虫号: 1578292
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- 专业: 肿瘤研究体系新技术
4楼2012-07-19 13:16:52
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