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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 转座子插入随机突变如何保证单次插入？
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quiller2000

木虫 (著名写手)

[求助] 转座子插入随机突变如何保证单次插入？

hi,大家好

偶以前没有做过这类工作，我想了解，在用Tn5转座子做随机插入突变体的时候，如何保证在抗性平板上分离出来的克隆是单一插入呢？

还有，在结合转移的时候，会不会第一个Tn5质粒进入受体菌后，发生一次转座插入后，这个细胞还会接受第二个Tn5质粒，从而发生第二次转座？

感谢各位！
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致良知
1楼2012-06-27 23:57:36
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farmer@

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chen5955227 at 2012-07-24 09:30:26
(1)Tn5转座子载体均为自杀性载体, 必须在特定的宿主中才能复制;   
(2) 转座区域带有可选择的抗生素抗性基因, 便于突变体的筛选;
(3) Tn5能抑制自身的转座, 保证在突变菌株上的单拷贝插入, 有利于突变性状的筛选 ...

你好，请问有没有Tn5这个转座子的序列呢？没有序列的话后续突变位点怎么定位呢？谢谢
我用的是Tn5-233这个转座子，在质粒pRK607上。
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8楼2013-06-08 12:27:28
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chen5955227

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+5, MicEPI+1, 这个解释非常强大 2012-07-24 10:29:16
(1)Tn5转座子载体均为自杀性载体, 必须在特定的宿主中才能复制;   
(2) 转座区域带有可选择的抗生素抗性基因, 便于突变体的筛选;
(3) Tn5能抑制自身的转座, 保证在突变菌株上的单拷贝插入, 有利于突变性状的筛选;
( 4)转座子在插入位点留下一段已知DNA序列, 比传统的诱变方法更容易定位;
( 5) 由于转座酶不发生转座, 转座子在DNA 上稳定存在, 保证了突变性状的稳定。
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2楼2012-07-24 09:30:26
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quiller2000

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chen5955227 at 2012-07-24 09:30:26
(1)Tn5转座子载体均为自杀性载体, 必须在特定的宿主中才能复制;   
(2) 转座区域带有可选择的抗生素抗性基因, 便于突变体的筛选;
(3) Tn5能抑制自身的转座, 保证在突变菌株上的单拷贝插入, 有利于突变性状的筛选 ...

感谢您的回复，但是您说的这些情况都是基于质粒只转入细胞一次的情况；有没有可能细胞接受一个转座子之后再接受一个转座子插入，或者同时接受了两个转座子插入呢？
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致良知
3楼2012-07-25 21:07:27
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chen5955227

铜虫 (初入文坛)
★
scelab: 金币+1, good 2012-08-10 21:27:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by quiller2000 at 2012-07-25 21:07:27
感谢您的回复，但是您说的这些情况都是基于质粒只转入细胞一次的情况；有没有可能细胞接受一个转座子之后再接受一个转座子插入，或者同时接受了两个转座子插入呢？...

没能明白你的意思。。。对大多数细菌转座子而言, 它们的转座频率是相当低的, Tn5和Tn10分别为10-4、10-5，这样在一个经转座诱变的细胞群体中，双重转座频率低于10-10，所以双重突变体几乎是不存在的
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4楼2012-07-26 10:08:08
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