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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我想做苜蓿抗热基因这一方面，但是现在思绪很乱，不知道从何入手，望高手指点
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sunny2012622

新虫 (初入文坛)

[求助] 我想做苜蓿抗热基因这一方面，但是现在思绪很乱，不知道从何入手，望高手指点

我想做苜蓿抗热基因这一方面，但是现在思绪很乱，不知道从何入手，望高手指点
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1楼 2012-06-25 10:25:19
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)
定位、克隆还是功能鉴定，或者其它方面，麻烦lz说清楚。
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2楼2012-06-25 13:52:09
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sunny2012622

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by coal@live.cn at 2012-06-25 13:52:09
定位、克隆还是功能鉴定，或者其它方面，麻烦lz说清楚。

1、师兄通过ssh消减杂交技术构建了一个cdna文库，筛选出了一些cDNA片段，我要接着往下做，然后不知道该怎么做，这个应该算是功能鉴定吧
2、想克隆出些抗热因子，然后转入苜蓿中，研究其抗热作用，但是我不知道怎么克隆抗热因子，人家研究的bzip28 、HSF1等抗热因子不知道人家是怎么知道然后克隆的，我也想找一个抗热因子然后研究下不知道咋找，谢谢
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3楼2012-06-25 15:48:56
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jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流！ 2012-06-25 18:17:54
如果要接着你师兄的往下做，那么有一个思路供你参考：
先对文库克隆测序（如果你师兄没有做的话），然后进行blast分析这些cDNA片段，找到可能跟耐热/抗热相关的基因片段，然后做race把这个基因的全长得到。接着就可以表达这个完整的基因或者是部分。拿到蛋白了，就可以进行后续的功能相关的实验了。
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4楼2012-06-25 17:07:17
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cato8163

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-26 16:40:55
3楼说的对。一般是这样的程序。
从cDNA文库中，找到EST片段（非常重要，决定你后面的实验）。一般，通过，blast，找到同源的，这样做起来，比较可靠。
转个模式植物，最好是紫花苜蓿，在T0代进行耐热性实验。
加油。
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5楼2012-06-25 19:17:38
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cato8163

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-26 16:41:12
前期克隆，RACE，一个月。快的，两周。
构载体2-4周。
转化农杆菌、鉴定：1-2周。
转化苜蓿（不太好做，国内做的不太好），顺利的，24周左右。
加紧时间了。
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6楼2012-06-25 19:21:48
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coal@live.cn

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 很热心的虫虫 2012-06-26 16:41:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by sunny2012622 at 2012-06-25 15:48:56
1、师兄通过ssh消减杂交技术构建了一个cdna文库，筛选出了一些cDNA片段，我要接着往下做，然后不知道该怎么做，这个应该算是功能鉴定吧
2、想克隆出些抗热因子，然后转入苜蓿中，研究其抗热作用，但是我不知道怎么 ...

你师兄消减杂交得到的cDNA就是苜蓿分别在高温和常温两种条件下差异表达的cDNA了吧？如果是这样的话接下来应该就如3L、4L所说那样做了，值得注意的是拿到感兴趣的cDNA片段序列后既可以用race拉基因全长，也可以根据EST信息拼基因全长，不过通常前者更可靠。
得到几个你认为可能的候选基因后可以先做做southern和real time PCR，验证该基因到底是不是在高温时特异表达及表达量有何变化等；
接下来就是转基因了，能转苜蓿最好，不能的话就只好转模式植物，转后同样需要用southern或real time PCR等手段验证基因的表达，若是表达的话再进行表型验证（就是看它到底是不是比一般的更耐热）。
想做得深点还可以把相应的蛋白质给找出来神马的……

ps：我没做过该实验，以上内容仅供参考。
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7楼2012-06-25 22:58:19
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sunny2012622

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by coal@live.cn at 2012-06-25 22:58:19
你师兄消减杂交得到的cDNA就是苜蓿分别在高温和常温两种条件下差异表达的cDNA了吧？如果是这样的话接下来应该就如3L、4L所说那样做了，值得注意的是拿到感兴趣的cDNA片段序列后既可以用race拉基因全长，也可以根据 ...

谢谢
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8楼2012-06-26 15:09:03
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sunny2012622

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cato8163 at 2012-06-25 19:21:48
前期克隆，RACE，一个月。快的，两周。
构载体2-4周。
转化农杆菌、鉴定：1-2周。
转化苜蓿（不太好做，国内做的不太好），顺利的，24周左右。
加紧时间了。

谢谢
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9楼2012-06-26 15:09:20
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sunny2012622

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cato8163 at 2012-06-25 19:17:38
3楼说的对。一般是这样的程序。
从cDNA文库中，找到EST片段（非常重要，决定你后面的实验）。一般，通过，blast，找到同源的，这样做起来，比较可靠。
转个模式植物，最好是紫花苜蓿，在T0代进行耐热性实验。
加 ...

谢谢
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10楼2012-06-26 15:09:34
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