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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家做RT-qPCR设计引物用的什么软件呀？
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 大家做RT-qPCR设计引物用的什么软件呀？

大家做RT-qPCR设计引物用的什么软件呀？荧光定量PCR的引物应该和常规的PCR引物不一样吧，应该对引物要求更高吧。
还有个问题，primer5就是primer premier5吗？都是MIT开发的吗？
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cookies12 2018天天

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好孩子！
1楼 2012-06-20 14:47:31
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yuanyi204

木虫 (正式写手)
因物设计，怎么老爬不出来呢，是方法问题还是药品问题呀
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12楼2012-12-28 00:02:16
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+10, ★★★很有帮助, 西瓜哥就是给力啊！！！ 2012-06-20 16:58:55
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 西瓜斑斑实在是太给力了 2012-06-20 17:22:16
我是只用Primer Premier 5（Primer 5）来设计，主要参考了Takara的试剂盒说明书上对于引物设计的要求（如图）。
其他就是普通PCR引物的要求了，而这些只要看引物设计软件的评分就可以了，评分越高越好。我自己用Primer Premier 5设计，大部分都是95分以上的才用。
如果是用Sybr Green，由于双链DNA都会引起荧光信号，所以尽量不要有错配、二聚体、发夹结构这些东西，在这里，这些比Tm值、GC含量还要重要些。实在免不了，那么其结合强度也不能高。可以看评分里面的AG值（如图），绝对值越大，结合强度越大。具体的我不是很清楚，只记得以前生物信息学上老师说过不能大于10。我自己有好几对引物的二聚体AG值在-6左右，用着倒是很正常。
另外，荧光定量PCR常用cDNA为模板来检测表达量，这种时候就需要避免基因组DNA的干扰。在引物设计上，有一些技巧可以避免基因组DNA得到扩增：1.让上下游引物中间隔着一个大的内含子，这样基因组DNA的产物由于太大，扩增效率很低。
2.让引物的5'端和3'在不同的外显子上，这样引物就不能结合到基因组DNA上啦。

以上就是本人在设计荧光定量PCR引物上的一些经验。引物到底好不好，最好还是要看荧光定量PCR的结果，看熔解曲线，如果只有单一的峰，说明产物很特异，引物可以用。
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2楼2012-06-20 16:28:28
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cnb1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-06-20 16:28:28
我是只用Primer Premier 5（Primer 5）来设计，主要参考了Takara的试剂盒说明书上对于引物设计的要求（如图）。
其他就是普通PCR引物的要求了，而这些只要看引物设计软件的评分就可以了，评分越高越好。我自己用Pr ...

西瓜你好，我在设计引物的时候，3'端尽量避免A呢还是T呢？有好多版本，我现在设计了个引物是3’端是A，可以么？
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4楼2012-07-01 12:02:36
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
自己再顶一下

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好孩子！
5楼2012-07-01 13:13:01
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