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【答案】应助回帖
荧光原位杂交（FISH）的实验步骤
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技术问世于20世纪70年代后期，是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的。其基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互 补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定 量。试验方法如下：
1）玻片处理
（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1%盐酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片1%（质量分数）盐酸煮沸10min，烘干，锡纸包好4℃保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中10min，然后60℃烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡处理(37℃、2h，室温过夜)，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃过夜。称量试剂勺也 要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒，为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经0. 5mL/L DEPC水溶液处理3h以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无RNase和DNase的枪头、试管可不必处理直接使用。
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用1mL/L DEPC水配制。
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：
（a）缓冲溶液
1×PBS缓冲溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超纯水；
3×PBS缓冲溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超纯水；
通常配制成10×PBS的储备液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀释获得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
称取2gPFA加入30ml约60℃的热水，滴几滴20%NaOH放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3×PBS缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用HCl调整至中性（7.2左右），拿出搅拌子。向PFA溶液中加入超纯水，定容在50ml。用 0.45微米的膜过滤后使用。（室温或4℃保存备用）。
注意：
1、配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；
2、加热时，温度不宜过高，常为60~65℃，否则，PFA降解失效；
3、配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。
4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在2～3小时，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
（c）配制50%，80%，98%无水乙醇溶液，每个总量20mL。
（d）DAPI溶液
用1mlddH2O将DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。取适量DAPI水溶液加到PBS中，制备成10～50 µM的DAPI溶液。
3）取样及保存方法
（a）反应器沉淀前取样2～5mL至离心管。
（b）离心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸馏水重复两次）。
（c）样品加入1mL多聚甲醛，摇匀，4℃下放置3h。
（d）样品离心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1×PBS，摇匀，离心(10000r/min)5min，去上清夜（重复3次）。
（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL无水乙醇，摇匀，-20℃保存（可保存6个月）。
4）样品固定：
稀释样品3～5倍，对样品进行超声处理（3W超声2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超声5min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜 计数。然后取3μL样品涂于包埋明胶的玻片上（检查样片本底），37℃的热烘箱固定2h（或者在空气中干燥2h或者过夜）。依次用50%、80%、98% （质量比）乙醇浸渍3min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。
5）样品杂交
试验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液（Washing Buffer, WB），其组分如表1-1和表1-2。
表1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）
5% 10% 20% 30% 35% 40%
0.05%SDS（μL） 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
50mMTri-HCl（μL） 24 24 24 24 24 24
5mol NaCl（mL） 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32
甲酰胺（mL） 1.2 2.4 4.8 7.2 8.4 9.6
蒸馏水（mL） 18.4548 17.2548 14.8548 12.4548 11.2548 10.0548
探针 Nsm156 Ntcoc206 Ntspn693 Nsv443 Ntspa662 NSO1225 Nmv NIT3
表1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）
组分 体积
0.05%SDS 0.6μL
50m MTri-HCl 12μL
5mol NaCl 2.16mL
蒸馏水 42.8274mL
（a）吸取2mL杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在46℃杂交炉中放置数分钟。
（b）吸取10μL探针贮存液和80μL杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入46℃杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为25ng/μL，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表1-3所示。
表1-3用于检测样品中AOX、NOX的寡核苷酸探针及杂交条件
探针 探针序列(5’～3’) 标记细菌种属1 浓度a
NSO1225 CGCCATTGTATTACGTGTGA Ammonia oxidizing beta-proteobacteria 35
Nsv443 CCGTGACCGTTTCGTTCCG Nitroso-spira, -lobus, -vibrio 30
Nmv TCCTCAGAGACTACGCGG Nitroso-coccus 35
Ntspa662 GGAATTCCGCGCTCCTCT Nitrospira 35
NIT3 CCTGGCTCCATGCTCCG Nitrobacter 40
Ntcoc206 CGGTGCGAGCTTGCAAGC Nitrococcus mobilis 10
Ntspn693 TTCCCAATATCAACGCATT Nitrospina gracilis 20
注：
（a） 表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（c）吸取9μL预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于46℃下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为2～3h；
（d）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到48℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48℃水浴20min后用4℃冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
DAPI染色
每孔滴9uLDAPI，4℃暗处5min，4℃冰水（BPS缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有360 nm激发波长，460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。
封片
涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集20个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过1000个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数 目（cells/g或cells/L）为AS1/(S2V)，其中A为视野中细菌平均数；S1为样品涂抹面积；S2为视野涂抹面积；V为样品体积。 |
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