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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE做了两次，图片相差很大，还有空白对照也有条带。
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shuwolf

新虫 (小有名气)
★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-09 13:37:12
1\纯化PCR产物
2、尽量保证每次电泳的胶的浓度梯度一致，
此两点很重要
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人生就是修行
11楼2012-06-09 09:56:13
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elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 侯云hy at 2012-06-09 09:46:54
我之前也试过纯化和未纯化的比较，差别比较大，然后我导师就不让我纯化，可是不纯化泳道颜色好深啊。你有没有遇到这种情况啊？...

为什么不让你纯化啊，许多人都纯化的。涌到颜色深部知道，我用SYBR 染色。
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12楼2012-06-09 20:10:02
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侯云hy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by elbo at 2012-06-09 20:10:02
为什么不让你纯化啊，许多人都纯化的。涌到颜色深部知道，我用SYBR 染色。...

他说纯化有损失，让我尽量减少PCR和DGGE之间的步骤
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13楼2012-06-10 10:16:18
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elbo

金虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-11 13:54:45
引用回帖:
13楼: Originally posted by 侯云hy at 2012-06-10 10:16:18
他说纯化有损失，让我尽量减少PCR和DGGE之间的步骤...

如果你PCR产物浓度很高的话，纯化也丢失不了多少，小片段的PCR产物回收率还是很高的。肯定都在80%以上。如果PCR产物检测的时候，条带没有M亮，那么就是不纯化跑出来DGGE也不好。根本问题还是要DNA模版要纯，浓度高，1ul的PCR产物出来都很亮很亮。
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14楼2012-06-10 13:04:32
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侯云hy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by elbo at 2012-06-10 13:04:32
如果你PCR产物浓度很高的话，纯化也丢失不了多少，小片段的PCR产物回收率还是很高的。肯定都在80%以上。如果PCR产物检测的时候，条带没有M亮，那么就是不纯化跑出来DGGE也不好。根本问题还是要DNA模版要纯，浓度高 ...

您能否帮我看下，在我胶的上半部分，有条带，但是条带上下有弥散现象，我将条带和弥散的部分都割胶回收测序，发现这些都是同一条序列。是不是我的DGGE的电压有问题还是其他的问题啊？电压80v 12.5h，上样量20ul 谢谢啊？
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15楼2012-06-10 21:24:23
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 侯云hy at 2012-06-09 09:45:16
我用的是TAKALA 的 EX Taq酶，这个酶可以吗？你用的是哪个啊？...

TAKARA的酶可以。
用到如果过于黑，尝试减少上样量试试吧。
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16楼2012-06-11 08:29:27
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

同样的问题在我这里也发生了，初步怀疑是水污染了。
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17楼2012-06-11 10:29:03
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侯云hy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by xiadongliang at 2012-06-11 08:29:27
TAKARA的酶可以。
用到如果过于黑，尝试减少上样量试试吧。...

上样量15ul也还是颜色重。
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18楼2012-06-11 10:35:23
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我现在上样才7uL PCR产物
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19楼2012-06-12 08:13:46
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waldenpond

金虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by elbo at 2012-06-10 13:04:32
如果你PCR产物浓度很高的话，纯化也丢失不了多少，小片段的PCR产物回收率还是很高的。肯定都在80%以上。如果PCR产物检测的时候，条带没有M亮，那么就是不纯化跑出来DGGE也不好。根本问题还是要DNA模版要纯，浓度高 ...

我的条带就很暗，能不能PCR产物电泳回收再跑一次PCR，增加点样DNA的量啊？这个方法你觉得可不可行？
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20楼2012-07-01 11:34:14
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