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wsw2t

银虫 (初入文坛)

[求助] 请教各位大侠:双向电泳蛋白定量用bradford法的问题!!

双向电泳提肌肉蛋白,提完后用bradford方法测蛋白浓度,但包括标准曲线在内,值不停变动,不知道问题出在哪里,求救!具体方法如下:
用蒸馏水配1mg/ml BSA,各试管分别加入0,10ul,20ul,40ul,60ul,80ul,100ul,用裂解液补齐到100ul。之所以用裂解液,是因为样品是用裂解液溶的,而且裂解液中含有8M的尿素,居然尿素也要跟考马斯亮蓝反应。再加入5ml 考马斯亮蓝,用过试剂盒里的考马斯亮蓝,也自己配过。混匀后立即测,也做过5min后测,10min后测,但在595nm下吸光值不断增大,不稳定。
不知道各位有没有碰到类似的情况?是什么原因造成的呢?这样测出来的蛋白浓度不敢相信啊,只能估测个大概,但后面做双向电泳,是不是还是应该比较准确地定量呢,因为后面结果分析里面,蛋白点差异1.5倍就算是差异蛋白了,如果定量不准确的话,如果是上样原因造成的,那可如何是好啊!由于上样引起的差异是不是可以在后面用软件去掉?
另,做双向电泳的同学都是用什么方法定量的呢?
刚开始做,很菜鸟,忘各位不吝赐教,万分感激!
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

我们都是用水稀释的,样品里的裂解液也会影响该法对蛋白的定量吧,你可以考虑下将样品脱盐后测个浓度比较一下。
14楼2012-06-05 15:22:36
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 鼓励应助! 2012-05-24 10:59:39
不确定是咋回事,但我做的时候补齐100ul是用去离子水。不知道裂解液会不会影响反应。待测样品由于量很少,尿素的影响不会很大。
加入考马斯亮蓝后需要反应5~10min,在30min左右测完。
同一批样品在一起检测,误差是相似的。
定量更主要是为了保证批间差异不至于过大,结果能重复。双向的重复性本来就很差。

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2楼2012-05-24 10:55:18
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不可以使用普通的bradford法,应该用上海生工的非干扰型蛋白浓度测定试剂盒  SK3071

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2012-05-24 11:34:34
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wsw2t

银虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-24 10:55:18:
不确定是咋回事,但我做的时候补齐100ul是用去离子水。不知道裂解液会不会影响反应。待测样品由于量很少,尿素的影响不会很大。
加入考马斯亮蓝后需要反应5~10min,在30min左右测完。
同一批样品在一起检测,误差

那请问你做的时候值稳定吗?你是反应10min后测的?我也做过10min后测,也不稳定。我以前做其他样品的时候,用试剂盒带的标准蛋白测,以及我的样品,值都是稳定的,不知道为什么现在BSA都不稳定。跟BSA的纯度有关系没呢?
谢谢您的回复!欢迎继续交流!
4楼2012-05-24 14:16:51
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