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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 崩溃ing---PCR后无条带问题
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

[求助] 崩溃ing---PCR后无条带问题

本人打算做T-RFLP，现在正在做土壤总细菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR体系（25ul）是：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer缓冲液（5U/uL），模板0.5uL，以水补齐。PCR条件是94℃预变性5 min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5 min，35个循环，72℃下延伸10min。按照这个条件，无法P出条带。期间，也换过EB染色液、TAE，但问题依旧。大家帮忙分析一下是什么原因吧。
还有，用先前提取的大田土壤DNA可以P出来，但是用我前两天刚刚提取的室内土样DNA竟然无法P出。下面个给出两种DNA的具体参数：
土样   浓度     260       280      260/280     260/230  PCR情况
大田    65.4     1.307     0.757     1.73           0.89         可以P出
室内    59.6     1.192     0.680     1.75           0.25         无法P出
室内    60.9      1.218    0.711    1.71             1.16         无法P出
请大家帮忙看看，这是怎么回事啊 ？
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1楼 2012-05-10 08:34:02
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elbo

金虫 (小有名气)
找到志同道合的了，我也在做TRFLP。首先一般情况下DNA都需要纯化。反应体系配置过程一定要仔细，建议加大模板量。 PCR条件自己摸索还是拿的别人，另外 建议循环数减少到25,（据研究报道，减少循环数能够减少碱基错配）
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12楼2012-05-12 11:29:50
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-10 13:51:30
liuxing1-1: 金币+1 2012-05-10 16:30:27
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-10 11:36:18
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊

我提取的是土壤DNA啊，不是RNA
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3楼2012-05-10 11:47:33
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-05-10 16:30:21
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-11 17:35:35
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 11:36:18:
呵呵，个人浅见啊，我觉得是材料的问题，你要的是16s核糖体RNA，这个家伙是翻译蛋白用的，你室内的的土样肯定比大田活性低的多，你检测时的结果大概是混有DNA，反正不能保证完全是RNA，你可以参考一下，实验顺利啊

做16S一样可以从DNA开始的，不一定要提RNA再RT-PCR。16S rDNA这也不是什么新鲜概念了。

问LZ一个问题，你提完DNA就只测一个紫外就完了么？没有跑胶检测一下？DNA降解是可能的原因之一。另外，建议你做PCR的时候设置两个对照，阳性对照（确定能P出来的样本做模板）和阴性对照（无模板，补水），这样有利于分析结果，排除误差。
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4楼2012-05-10 15:07:33
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查看全部 17 个回答
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