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johnny4890新虫 (小有名气)
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提取RNA与做RT-PCR的问题
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最近从霉菌中提取总rna，质量不好，反转录老是做不出来，而且pcr的时候经常把水那组p出条带来==。请大家给我点意见。先看看我的总rna电泳图。 （第一次） （第二次）所用的protocol是网上下载的山寨版本。如下： RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤: 1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。 |
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25楼2013-04-21 21:51:05
atlanticwi
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johnny4890: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-02 21:38:16
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嗯................ 我觉得，这样的RNA肯定是不能用的，电泳结果显示出你的RNA降解的比较严重，同样有Smear的话，基因组DNA还是有污染的，网上的这个Protocol我看基本的操作没有问题，主要是TRIzol试剂你是怎么配的呢，还是买的商业化TRIzol？同样具体应用到你菌的RNA提取上，不知道这个Protocol是否适用............. 个人看法 若有说错请高手指点  |
2楼2012-04-30 20:38:11
johnny4890
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3楼2012-04-30 20:47:45
atlanticwi
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4楼2012-04-30 20:49:31
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