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dingfang0707金虫 (正式写手)
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[求助]
前脂肪细胞培养
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我最近在体外培养鸭前体脂肪细胞，但每次看到的细胞量都非常少，即使传代后也是零零散散那么几个细胞，少得可怜。请高手指点一下。谢谢 PS：每次取样：孵化后1周龄的小鸭子5只左右，腿部、腹部脂肪细胞。 |
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dingfang0707
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5楼2012-04-10 08:49:52
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小丹木木: 金币+3, 鼓励，很热心哦 2012-04-09 14:22:52
小丹木木: 金币+3, 鼓励，很热心哦 2012-04-09 14:22:52
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感兴趣，查了下，结果是小鼠的，仅供参考： 正常小鼠前脂肪细胞的培养 实验材料： 1. 细胞来源：8—12天龄的小鼠； 2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1&time，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.4； 3. 消化液：0.3%胶原酶溶液，含4%牛血清 白蛋白。用Hanks液配制； 4. DW培养液：DMEM和WAJC404培养液按1：1（V/V）混合，添加100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素； 5. 培养液a：DW培养液，10%胎牛血清 ； 6. 培养液b：DW培养液，补充胰岛素10μg/ml、转铁蛋白10μg/ml、成纤维细胞生长因子 （FGF）10ng/ml和高密度脂蛋白（HDL）溶液5μl/ml； 7. 高密度脂蛋白（HDL）溶液：含蛋白质18mg/ml和胆固醇10mg/ml； 8. 地塞米松：工作浓度为10-7mol/L； 9. 筛网：孔径分别为250μm与80μm的尼龙网筛； 实验方法： 1. 取材； 1） 取8—12天龄的小鼠，窒息处死后，置于冰块上； 2） 在无菌条件下迅速切取腹股沟的脂肪垫，放入液中； 3） 清除脂肪垫中的大血管和结缔组织，洗净血污。称取脂肪垫的重量； 2. 分离细胞； 1） 将脂肪垫剪成1mm3左右的小块，转入50ml锥形离心管 中； 2） 每0.1g组织块加入3—4ml消化液。在37℃水浴 摇床 上以60r/min的转速轻微振荡，消化1h。其间每隔10min取出离心管 ，摇动，使组织块与消化液充分混匀； 3） 消化完后，用吸管 反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液； 4） 用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液，除去未分散的组织块，收集滤液。将滤过液再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，除去大部分成熟脂肪细胞，收集滤液； 5） 将最后得到的滤液离心（700g，7—10min）。吸弃漂浮的脂肪细胞和消化液； 6） 用培养液a清洗细胞，离心（700g，7min）。将细胞团制成悬液，再离心。最后，将细胞沉淀用培养液a重新制成细胞悬液； 3. 原代培养； 1） 用培养液a调节细胞密度。将细胞以1.5&time104个/cm2的密度接种于培养板中； 2） 24h后，用DW培养液彻底清洗细胞，除去培养物中残留的胎牛血清和未贴壁的细胞（主要为红细胞）； 3） 换入培养液b，在37℃、5%CO2培养箱中培养。以后用培养液b维持培养。每3d换液一次； 4） 在细胞汇合成片后，继续培养；或于细胞汇合成片后第五天，在培养液b中加入10-7mol/L地塞米松，继续培养； 5） 培养至出现漂浮细胞时，即可收货细胞，进行鉴定 |
3楼2012-04-09 10:29:31
4楼2012-04-09 10:31:01
dingfang0707
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6楼2012-04-10 08:50:22
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