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anxiuhong

新虫 (初入文坛)

[求助] 抗体问题

大家好，最近找公司做了一个抗体，发现抗体显示的带不是我的目的条带，图片上面是SDS-PAGE染色的胶，下面是Westen的片子，点样顺序在图片下方，我的蛋白是拟南芥总蛋白，我的目的带是38kd。想问一下SDS中最亮的那条大约55kD的带是什么东西，并且western检测的条带也大约是55kd的，我觉得就是SDS上的那条最亮的带，请问是抗体不特异造成的吗？还是其他原因？谢谢！

上面：SDS-PAGE  下面：Western blot
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1楼 2012-04-06 12:16:30
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
你在SDS-PAGE 标记一下靶带的位置
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2楼2012-04-06 12:35:29
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是抗体重链吧..........
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3楼2012-04-06 13:14:47
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qjy_134

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ＳＤＳ上最亮的死５５ＫＤ,不是你的靶带了？　这样的话你免疫的蛋白不纯，下面最粗的也是５５ＫＤ位置蛋白。
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4楼2012-04-06 13:32:06
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anxiuhong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-04-06 12:35:29:
你在SDS-PAGE 标记一下靶带的位置

我的图片Marker标记的大小没有完全显示，SDS-PAGE图片最右边是fermentas的彩虹marker，从上到下箭头所指为100,70,55,40kd,我的靶蛋白应该就在最下面那个箭头附近，最左边是easysee marker。western图片最右边是easysee  marker，箭头应该是40kd的位置，4和5之间的marker是fermentas的彩虹marker，我每次显影都只能显出100和70kd的带，比较上下两张图片我觉得显出来的带差不多是55的带
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5楼2012-04-06 14:37:26
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anxiuhong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gongeleven at 2012-04-06 13:14:47:
可能是抗体重链吧..........

我们实验室做CoIP的遇到抗体重链的问题，但是做了那么多抗体只有我的western出现了这个问题，如果真是重链那这个抗体还能用吗 或者有什么方法去除
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6楼2012-04-06 14:51:45
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anxiuhong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gongeleven at 2012-04-06 13:14:47:
可能是抗体重链吧..........

我对重链轻链的概念不清楚，但是我觉得要真是重链的话是不是这八个样品显示的带应该是同样亮度的吧，但是，他们的亮度不一致，正好与上面SDS-PAGE的亮度差不多
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7楼2012-04-06 14:59:49
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by anxiuhong at 2012-04-06 14:59:49:
我对重链轻链的概念不清楚，但是我觉得要真是重链的话是不是这八个样品显示的带应该是同样亮度的吧，但是，他们的亮度不一致，正好与上面SDS-PAGE的亮度差不多

两条重链轻链，通过二硫键等组成抗体分子，抗体分子量约150kd，如果是还原胶，则轻重链会分开，电泳时候就会看到两种链
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8楼2012-04-06 15:11:19
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anxiuhong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gongeleven at 2012-04-06 15:11:19:
两条重链轻链，通过二硫键等组成抗体分子，抗体分子量约150kd，如果是还原胶，则轻重链会分开，电泳时候就会看到两种链

那就是说如果这显示的是重链的话，那么我的抗体不是完整的了，也就不能标记我的靶蛋白了？那怎么才能消除重链轻链呢？谢谢！
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9楼2012-04-06 15:19:52
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
anxiuhong: 金币+1, ★有帮助 2012-04-07 10:06:51
引用回帖:
9楼: Originally posted by anxiuhong at 2012-04-06 15:19:52:
那就是说如果这显示的是重链的话，那么我的抗体不是完整的了，也就不能标记我的靶蛋白了？那怎么才能消除重链轻链呢？谢谢！

试图搞清楚原因，这个抗体是怎么表达出来的，杂交瘤表达的？公司交付抗体时候有什么qc数据吗
western用的什么二抗？
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10楼2012-04-06 16:08:23
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