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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
thendlee: 金币+2, 有帮助, 这个是老师设计的 也是老师的课题 我帮着做而已 他说没问题 2012-03-15 14:14:06
建议重新设计引物,我上次用ECORV和另一个PST1,实验进行了一个星期都没有连上,郁闷了。重新设计的引物。
11楼2012-03-15 11:26:40
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thendlee

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by preciousun at 2012-03-15 08:21:54:
你的连接有三种情况, 载体自身平末端连接, 片断自身平末端连接,都不长菌;只有你期望的载体和片断的连接才是长菌得

不晓得你什么意思?载体以及片段的粘端和平端会自连? 再说如果载体自连的话也是会长菌的啊
12楼2012-03-15 14:12:49
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preciousun

金虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by thendlee at 2012-03-15 14:12:49:
不晓得你什么意思?载体以及片段的粘端和平端会自连? 再说如果载体自连的话也是会长菌的啊

载体的平末端和另一分子的载体的平末端相连, 而粘末端不会相互连接

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13楼2012-03-15 14:46:55
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
thendlee: 金币+2, ★★★很有帮助, 这个去磷的具体步骤怎么做? 2012-03-16 15:41:58
看了之后你还有几点没有试过:
1 连接温度可以放置到4度,我多次使用效果比16度好。
2 既然不长菌,就有这么几个可能性,一个就是目的片段未能连接到载体,而载体本身也没有自连,所以线性转化至感受态肯定不会长菌,另外就是抗生素质量问题,我们实验室出现过犹豫抗生素问题不长菌(注意不是长杂菌)的问题,最后就是感受态的问题,既然你试过商品和自己做的,那么这个可能性就很小了。
3 一个平末端一个粘性末端这种酶切连接按理说要比平末端好连,可以再考虑加长连接时间,24小时连接,将载体片段用去磷酸化处理,另外可以考虑加入PEG 8000来增加连接效率。
4 关于连接酶的问题,你试过很多,不过推荐TAKARA的SOLUTION I,效果比一般连接酶要好。
祝你好运。
14楼2012-03-15 15:13:20
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


thendlee: 金币+1, 有帮助, 我的目的片段就是从T载体上切下来的 2012-03-16 15:40:04
顺便说一句,既然你都做了这么多次酶切连接,不如将目的片段克隆到T载体之后再酶切回收,这样比直接酶切连接效率会高很多,毕竟PCR产物酶切效率很低。
15楼2012-03-15 15:14:32
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


thendlee: 金币+1, 有帮助, 这个我有做 空载体也不长 2012-03-16 15:38:39
还有,做转化做一个空载体对照,这样不但可以排除LB平板以及抗生素的质量问题,也可以对照看看你目的片段是否连接成功。
16楼2012-03-15 15:18:58
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thendlee

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by preciousun at 2012-03-15 14:46:55:
载体的平末端和另一分子的载体的平末端相连, 而粘末端不会相互连接

谢谢,这种情况还真不知道,就是说这样出现的是一个线性化的东西,出现这种情况的原因是什么呢?
17楼2012-03-16 15:43:59
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

去磷酸化是用商业的酶来处理,用TAKARA的CIAP  37度反应半小时,具体说明书上会有。
18楼2012-03-16 16:12:03
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
17楼: Originally posted by thendlee at 2012-03-16 15:43:59:
谢谢,这种情况还真不知道,就是说这样出现的是一个线性化的东西,出现这种情况的原因是什么呢?

一个平末端一个粘性末端,这样是可以连接的,不会有问题。只要粘性末端的酶是一样或者同尾就行,不会连不了。
19楼2012-03-16 16:13:44
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