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thendlee金虫 (正式写手)
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[求助]
虚心请教关于平—粘末端的连接问题
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用sal I和sca I这两个酶处理过目的片段和载体，纯化回收后连接，转化后板没有菌落，不知道哪里出现了问题。 这两个酶，处理后一个产生粘性末端，一个产生平末端，有人说这样的按正常的连接体系条件就可以，但我一直没有成功。 我在做的是构建全长，最后的这个1800bp的片段怎么也加不进去。 关于目的片段：是PCR产物，纯化处理过，测序正确。 关于载体：确定有这两个酶切位点，并且唯一。 关于T4连接酶：分别用过TAKARA、NEB、以及Fermentas。 关于连接体系：调整过多次比例。 关于反应温度：试过16度过夜、22度4小时等等。 关于抗性：这个还是不会弄错的。 关于感受态：自己做的，商品化的都用过 [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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huguangdong
至尊木虫 (职业作家)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
thendlee: 金币+2, ★★★很有帮助, 这个去磷的具体步骤怎么做？ 2012-03-16 15:41:58
感谢参与，应助指数 +1
thendlee: 金币+2, ★★★很有帮助, 这个去磷的具体步骤怎么做？ 2012-03-16 15:41:58
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看了之后你还有几点没有试过： 1 连接温度可以放置到4度，我多次使用效果比16度好。 2 既然不长菌，就有这么几个可能性，一个就是目的片段未能连接到载体，而载体本身也没有自连，所以线性转化至感受态肯定不会长菌，另外就是抗生素质量问题，我们实验室出现过犹豫抗生素问题不长菌（注意不是长杂菌）的问题，最后就是感受态的问题，既然你试过商品和自己做的，那么这个可能性就很小了。 3 一个平末端一个粘性末端这种酶切连接按理说要比平末端好连，可以再考虑加长连接时间，24小时连接，将载体片段用去磷酸化处理，另外可以考虑加入PEG 8000来增加连接效率。 4 关于连接酶的问题，你试过很多，不过推荐TAKARA的SOLUTION I，效果比一般连接酶要好。 祝你好运。 |
14楼2012-03-15 15:13:20
2楼2012-03-12 19:55:54
thendlee
金虫 (正式写手)
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3楼2012-03-13 10:38:31
4楼2012-03-13 13:58:52