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thendlee金虫 (正式写手)
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虚心请教关于平—粘末端的连接问题
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用sal I和sca I这两个酶处理过目的片段和载体，纯化回收后连接，转化后板没有菌落，不知道哪里出现了问题。 这两个酶，处理后一个产生粘性末端，一个产生平末端，有人说这样的按正常的连接体系条件就可以，但我一直没有成功。 我在做的是构建全长，最后的这个1800bp的片段怎么也加不进去。 关于目的片段：是PCR产物，纯化处理过，测序正确。 关于载体：确定有这两个酶切位点，并且唯一。 关于T4连接酶：分别用过TAKARA、NEB、以及Fermentas。 关于连接体系：调整过多次比例。 关于反应温度：试过16度过夜、22度4小时等等。 关于抗性：这个还是不会弄错的。 关于感受态：自己做的，商品化的都用过 [ Last edited by thendlee on 2012-3-12 at 19:34 ] |
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