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遥望87

银虫 (小有名气)

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[求助] PCR扩增结果

最近在扩增某基因的中间片段，刚开始时PCR结果经电泳检测有条带，后来在相同的条件下（PCR反应条件、cDNA及所用的试剂均一样）却怎么也扩不出来了，是引物的问题吗？（引物为简并引物，另外cDNA已用内参检验过，没有问题）。该问题已困扰鄙人很久了，望高手指点。非常感谢！

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夜空中最亮的星！

1楼 2012-03-08 21:32:18

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超然渡陈

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
遥望87: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2012-04-18 16:19:39

cDNA很容易降解的，虽然是放在-40℃，但是冰箱门经常开关的话几天之内也是会有降解，而且反复冻融几次也肯定有降解。最好是在逆转录之后把cDNA分装成几分，常用的那份放在-40℃，其它放在-80℃冻存。你可以再用你的体系检测内参看看是否是cDNA的原因。PCR结果不能重复有很多原因的。比如几次加样时使用枪头不是一批吸附性不同，PCR仪中放置在不同的孔中温度有波动以及升降温时间有差异，同一个公司同一种酶不同批号之间活性会有差异，PCR用水可以直接用双蒸水或者超纯水，灭过菌之后会变酸性等等。可以设计一个方案一一排除。或者为了省时间可以直接一套全换新的。