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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] pkd46质粒

请问含有pkd46质粒的菌株在含有氨苄培养基，42度过夜能生长吗?
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灰血动物

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1楼 2012-03-03 13:55:28
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): Good! 2012-03-06 10:34:59
pkd46是温度敏感性质粒，在42度不复制，理论上会丢失。
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2楼2012-03-04 09:15:01
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by fwks3518 at 2012-03-04 09:15:01:
pkd46是温度敏感性质粒，在42度不复制，理论上会丢失。

好的。谢谢。想请问下，我把质粒转化到我的宿主中，挑取阳性克隆，可是就是提取不到质粒，据说这个质粒拷贝数低，不好提，所以我现在就不知道我的质粒是否真的已经导入到宿主中了。师兄能不能给点经验。谢谢。
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3楼2012-03-04 10:39:38
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-03-05 11:03:55
thestormcong(金币+4): ★有帮助 2012-03-05 13:06:13
1）pKD46中含有Temperature sensitive replication 元件，是温敏型质粒，在37---42℃培养条件下质粒容易丢失。
2）pKD46是low copy质粒，其质粒我提过，加大一点菌体量提质粒还是很明显的，大约在6.3kb左右。
3）一般情况下，含有pKD46质粒的大肠杆菌在30℃培养以及诱导制备感受态，再转化你要敲除的质粒，然后放在37℃培养可以去除掉pKD46质粒！
祝实验顺利！
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4楼2012-03-04 15:53:53
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by srlee at 2012-03-04 15:53:53:
1）pKD46中含有Temperature sensitive replication 元件，是温敏型质粒，在37---42℃培养条件下质粒容易丢失。
2）pKD46是low copy质粒，其质粒我提过，加大一点菌体量提质粒还是很明显的，大约在6.3kb左右。
3 ...

好的，谢谢。质粒是别人那里买的，从他给的宿主菌里面提取，还是能提取到，但是转化到我的宿主中之后，就提取不到了。转化的时候有阴性对照，阴性对照有少数几个转化子，实验组有大量转化子，随便挑取转化子到AMP摇瓶，提取质粒，没有结果。
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5楼2012-03-04 17:40:43
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fwks3518

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
thestormcong(金币+6): ★★★很有帮助 谢谢！这是个不错的方法。 2012-03-05 13:06:00
pkd46的序列在NCBI可以查到，可以设计检测特异引物来快速鉴定其存在。
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6楼2012-03-05 10:04:34
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 鼓励应助！ 2012-03-06 10:36:34
pKD46在大肠杆菌中，37度过夜就会丢失的，42度只需要半个小时，加大菌体量是可以提到质粒的
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7楼2012-03-05 14:13:40
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-03-05 14:13:40:
pKD46在大肠杆菌中，37度过夜就会丢失的，42度只需要半个小时，加大菌体量是可以提到质粒的

谢谢回帖，可是上次我将转化子挑入含有氨苄的摇瓶，37度过夜，还是有菌体生长。然后这次我提高温度到42度了，明天会出结果，到时候再向你请教，非常感谢！
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8楼2012-03-05 22:10:27
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灰血动物

金虫 (小有名气)
请问 你使用的氨苄浓度是多少~~谢谢
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未完成
9楼2012-07-31 20:48:42
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 灰血动物 at 2012-07-31 20:48:42
请问 你使用的氨苄浓度是多少~~谢谢

50-100ug/ml. 你的质粒能给我共享下吗？一起探讨。我上次发现我的质粒有突变位点。
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10楼2012-08-01 10:59:20
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