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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物？
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR产物？

求救各位大师~PCR引物设计后产物大小显示100bp左右，但是P出来的条带都是500bp左右，这是什么原因？如何优化？做了退火温度优化，没有太大差别····
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
1楼 2012-02-29 21:25:46
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dingke_s

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 这是很有可能的，可以把引物和模板BLAST 2012-03-06 10:46:37
你的模板是基因组DNA还是cDNA?有没有内含子？
可能你P出来是非特异性条带，可能要重新设计引物。
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2楼2012-03-01 09:55:58
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
P这么小的片段不是很好做，查查是不是引物设计问题，有错配...
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3楼2012-03-01 09:57:34
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eagle00768

木虫 (小有名气)
★
小丹木木(金币+1): 鼓励 2012-03-03 11:52:10
引用回帖:
2楼: Originally posted by dingke_s at 2012-03-01 09:55:58:
你的模板是基因组DNA还是cDNA?有没有内含子？
可能你P出来是非特异性条带，可能要重新设计引物。

同意，可能是引物不好，如果你的带比较弱的话，应该属于非特异性扩增。二者，假如你的模版是gDNA，而你的两条引物范围内有内含子，那么就可能扩出比预想的要大的片段。你设计引物的时候是用基因全序列设计的还是仅仅是编码区的序列来设计的呢？
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4楼2012-03-01 11:06:58
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by eagle00768 at 2012-03-01 11:06:58:
同意，可能是引物不好，如果你的带比较弱的话，应该属于非特异性扩增。二者，假如你的模版是gDNA，而你的两条引物范围内有内含子，那么就可能扩出比预想的要大的片段。你设计引物的时候是用基因全序列设计的还是 ...

我的模板是基因组DNA，P出来的条带特别亮···
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
5楼2012-03-01 22:18:49
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欧朵拉

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by dingke_s at 2012-03-01 09:55:58:
你的模板是基因组DNA还是cDNA?有没有内含子？
可能你P出来是非特异性条带，可能要重新设计引物。

我的模板是基因组DNA····
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做自己喜欢的事情，心态决定一切~
6楼2012-03-01 22:19:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
非特异扩增，能不能将退火温度升上去？
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jiayoubashaonian
7楼2012-03-01 22:43:17
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这是设计RT-PCR引物吧，应该是你的引物不好，有非特异性扩增。你可以用DNAMAN自动设计出好多条引物，然后用Oligo评价引物，选择最好的
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8楼2012-03-02 09:52:19
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 有道理 2012-03-03 11:52:38
首先要看你的引物设计的时候有没有错配的，否则有可能跑到基因组其他人地方去了，序列不正确。
条带很亮，可以去测个序，也不贵，才500bp,如果包含你的母的片段，你再纯化后在PCR，可能结果会好些。
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总有一天我要修改用户名。
9楼2012-03-02 10:42:45
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youngcheng

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dingke_s at 2012-03-01 09:55:58:
你的模板是基因组DNA还是cDNA?有没有内含子？
可能你P出来是非特异性条带，可能要重新设计引物。

同意，这么小的片段一般直接合成比较好，不适合PCR
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10楼2012-03-02 11:02:59
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