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panda73

金虫 (小有名气)

[交流] 影响酶切的几个主要因素已有7人参与

影响酶切的几个主要因素:
1. 质粒DNA的质量
1)质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时,如果反复优化酶切条件后,都不能实现完全酶切,最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。
2)DNA的质量监测通常有两个方法:首先OD260/OD280比值应该在1.8左右(1.7-1.9),否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次,琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带(分别为超螺旋DNA,线性化DNA和环状DNA)。否则意味质粒DNA的质量不高,应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性
1)限制性内切酶一般需要低温保存,而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活,限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。
2)建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶(-20度),而且取用限制性内切酶时,也应该使用具有保温功能的冻存盒,尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量
1)限制性内切酶的单位定义通常为:在合适的温度下,完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2)在这个单位定义中,有几个不确定因素:首先是底物,不同的酶单位定义是选择的底物可能不同(常用的几个底物DNA包括:Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA);第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化,因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少,就直接影响了该酶的单位定义。
3)因而,在进行酶切时,用1ul酶(一般10IU/ul)消化1ugDNA的通常做法是很不科学的,这也导致在实际工作中,大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4)以前,我推荐了一个在线的双酶切设计软件,double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中,能够注意到,用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍(EcoRI + NheI),而且发现,小片段PCR产物(100-500bp)进行酶切时,需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5)该软件目前可以免费使用,用户名和密码都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php

[ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ]
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fwks

铁杆木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
楼主给的那个test进不去。
11楼2012-03-06 08:51:06
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酶切专家

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
这才是专家,惭愧,惭愧
2楼2012-02-28 10:57:03
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十口心思

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-02-29 08:18:11
得看用什么牌子酶了,现在的酶如NEB的HF酶,MBI的FAST酶都很好,无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多,也用不了那么多倍。质粒别降解了就行,至于两条带还是三条带,做个克隆无所谓。现在用盒子提的质粒,纯度都还不错。还有是任何生物反应不可能达到完全,酶切反应不能实现完全酶切的,无论你怎么优化。金无足赤。
3楼2012-02-29 01:11:50
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panda73

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 十口心思 at 2012-02-29 01:11:50:
得看用什么牌子酶了,现在的酶如NEB的HF酶,MBI的FAST酶都很好,无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多,也用不了那么多倍。质粒别降解了就行,至于两条带还是三条带,做个克隆无所谓。现在用盒子提的 ...

做一个克隆是可以无所谓,一周不行,可以两周,甚至三周时间去做。但如果要做很多个克隆呢,或者想建一个高质量的库呢。
当然,这些只是交流,仅供参考
4楼2012-02-29 09:53:34
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