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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » western blot中蛋白质转印问题
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lywac

铜虫 (小有名气)

[求助] western blot中蛋白质转印问题

请教各位虫友，在western blotting中蛋白转印后，mark不清楚，是什么原因？另外，请教各位，你们做的时候，电流、电压分别多大？给个参考，先行谢过啦
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等你，是我一生的承诺
1楼 2011-12-28 17:02:20
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dwc326

铁虫 (初入文坛)
其实能不能转过去有很多影响因素！
楼上各种条件都可以转，也就是说有个大致范围。
我们实验室常用条件：湿转
慢点的，转上去再吃个饭，休息会：恒压30V或者恒流200mA 2h, 70KD以下全部可以。70KD以上在此基础上外加350mA 30min，目前做的最大的是280KD指标，没有问题
快点的：直接350mA 30-40min,70KD以下没有问题。70KD以上同上。
注意到一个各位虫友没注意的问题：转膜液的酸碱也会影响效率，酸一点转的更好些，我们一般是常规转膜液800mL使用前加1.5~2mL 盐酸，再加甲醇，2mL的效率就比1.5的好。
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17楼2013-11-01 14:35:25
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neon_alone

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): good 2011-12-29 17:44:08
marker不清楚，你确定在转膜缓冲液加甲醇了吗？膜之前也要拿甲醇活化5-10秒钟
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2楼2011-12-29 14:15:28
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necilyx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-12-30 09:24:14
在转膜过程中，110mA恒流，90min，是不是转膜时间不够啊？一般来说小分子蛋白20kd一下转膜45min就可以，分子量大一些的90min就可以了。另外，转膜时，胶和膜贴在一起后尽量别在移动，不然条带不清楚，影响结果。
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聪明才智要为意外做准备~~
3楼2011-12-29 15:13:18
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ljw796

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+1): 鼓励交流！ 2011-12-30 09:24:21
能否说下你的实验步骤，以便于大家分析？
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4楼2011-12-29 16:13:39
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