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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » HPLC的C18柱堵塞，求解决方法
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鲜鲜橙多

木虫 (小有名气)

[求助] HPLC的C18柱堵塞，求解决方法

我前几天在用HPLC 的C18柱走蛋白，蛋白用生理盐水溶解，流动相是双蒸水。后来，有别人用甲醇走样品。她用完后，我用80%的甲醇冲洗了好久。然后直接以80%的甲醇做洗脱液，上样品，我想看看能走出啥峰来。结果，刚上完样品，柱子压力就超标了。分段检查上样的管和柱子都堵了。上样管，后来冲洗通了，但是柱子还是堵得。我在网上查得说根据样品液不同，不走检测器，反方向，用高浓度和低浓度的有机溶液低流速冲洗。我周五开始用80%的甲醇冲，0.1-0.3ml/min。压力还是很大，我昨天又用20%的甲醇冲洗，依旧无效。求解啊！！！
PS：柱子用了有一段时间了，平时流速就不超过0.6ml/min。
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1楼 2011-12-04 10:12:31
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鲜鲜橙多

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by fxgowen at 2011-12-04 15:41:04:
想知道你做的什么蛋白，等电点多少，用TFA配成相应pH的流动相20:80乙腈小流速下冲一冲看看有没有效果吧

未知样品，PH什么的不知道。实验中也没啥要求。我明天试试吧。谢谢
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5楼2011-12-04 21:51:15
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fxgowen

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-04 18:50:23
鲜鲜橙多(金币+3): 2011-12-07 17:46:10
想知道你做的什么蛋白，等电点多少，用TFA配成相应pH的流动相20:80乙腈小流速下冲一冲看看有没有效果吧
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鲜鲜橙多
2楼2011-12-04 15:41:04
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yantao2112

禁虫 (小有名气)

鲜鲜橙多(金币+3): 2011-12-07 17:46:15
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鲜鲜橙多
3楼2011-12-04 20:26:08
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鲜鲜橙多

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by yantao2112 at 2011-12-04 20:26:08:
一方面，我觉得你的流速太小了，调大一点，比如调到1 ml/ min;
另一方面，不知你的蛋白分子量有多大，是不是蛋白给堵住了，还有就是你的蛋白等电点，你关注没有。

一是，流速上不去，打开柱子的另一侧，流速调到0.7ml/min，压力就达到18了，设置的最高压力是20。
二，蛋白分子量应该是很小，其实也不算蛋白，硫酸铵沉淀后的上清液通过一系列的处理，走HPLC。猜测是多肽类物质，等电点什么的根本不知道( ⊙ o ⊙ )啊！
之前这个样品走HPLC2,3个周了，没有问题。这次是别的实验室的人借我们实验室的仪器走她们的样品，估计走完了也没用缓冲液冲洗，我第二天走缓冲液，开始都还好，结果刚上了一针样品，立马堵了。
愁，还不敢告诉老师。前几天刚花了1千多修了在线脱气机。
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4楼2011-12-04 21:06:14
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