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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yalan_p

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达蛋白诱导不出来

最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体,测序结果显示没有出现碱基的位移和变异,但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白,我的蛋白在23kD左右,GST标签为26kD,诱导后在50kD左右应有比较亮的条带,但是SDS电泳显示30摄氏度诱导4h后的蛋白表达与对照是一样的。上清和沉淀都分别做了电泳,都是一样的结果。
    请教高手,这种情况我该怎么办?可能是什么原因?该如何进一步优化条件?
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小小细胞啊

新虫 (小有名气)

我跟你情况一样  pGEX-4T 表达的融合蛋白50KDa,跑胶出来相应的位子蛋白没有明显的变化,反倒是大概56KDa的位子处诱导有明显变化,开始怀疑可能是有部分修饰或者由于某些原因蛋白理论值和SDS-PAGE胶图现实的大小不太一样,结果用WB验证了,杂不出来,有很多其他位子的细带。现在刚提了质粒送测序,希望能找到原因。请问你有pGEX-4T的载体序列码?能否发我?谢谢
17楼2016-01-14 19:39:55
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yalan_p(金币+1): 唉,基本原理我也明白,现在已经做过了IPTG0.1mmol到1mmol,时间从3到5小时,就是诱导温度还没有改,之前一直是30度诱导 2011-10-26 21:55:17
不同的诱导时间点,
不同的诱导剂量,
不同的诱导温度
2楼2011-10-26 20:19:33
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

★ ★
adslye(金币+2): 很好的建议!鼓励交流~~ 2011-10-27 09:26:31
我估计换16度和25度也不会有什么表达。

分析下是不是有稀有密码子,换宿主吧。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-10-27 00:04:52
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sl35537417

木虫 (正式写手)

引用回帖:
1楼: Originally posted by yalan_p at 2011-10-26 18:17:26:
最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体,测序结果显示没有出现碱基的位移和变异,但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白,我的蛋白在23kD左右,GST标签为26kD,诱导后在50kD左右应有比较亮的条带,但是SDS电 ...

更换载体或者宿主
4楼2011-10-27 09:05:05
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