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joyjane88

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 各位虫友，谁做过原核基因组补洞工作，本人遇到一些问题想请教一下。

各位虫友，本人正在完善实验室一株细菌的基因组全图，也就是gap closure这项工作。前期的一些gaps很容易就搞定了，pcr+sequencing.现在到接近尾声的地步了，剩下几个gaps,两个sequece gaps,三四个physical gaps，尝试了多种方法都得不到PCR产物。用过的PCR方法有常规-，长距离-，多重-PCR，使用过高GC buffer，调整过引物、模板浓度和酶的用量，重新设计了引物，Takara的genome walking kit也尝试过了。是不是还有哪些方面可以改进，或者还有什么方法可以尝试？？？现在有点不知所措，望各位好心的虫友们多多给些意见和建议。

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1楼 2011-10-04 11:25:47

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lly401064

木虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

joyjane88(金币+5): 谢谢，曾经blast gap侧翼序列，其中一个内洞两侧和另一株菌比对上，中间有几百bp，想来这个gap是拼装错误的可能性不大。可就是PCR扩不出来，而且“另一菌株”用相同的引物就能扩出来。经分析gap这个地方是较长序列片段的重复，避开重复序列设计引物依然无果。能否再给点意见，谢谢！！！ 2011-10-04 15:50:18

你好，我有两个建议：
首先考虑一下有没有错拼的可能性，其次是在距离gap末端相对较远的地方设计引物，因为NGS测序有可能会出现错误。
希望能够对你的问题有所帮助。