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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 相对定量PCR求助
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物质鉴定

金虫 (正式写手)

[求助] 相对定量PCR求助 已有2人参与

本人刚接触分子，想请教各位牛人有关实时定量荧光PCR的一些问题。我要做不同土壤位点某类微生物的相对量的多少，所以想做相对定量PCR，初步的实验思路如下：
1提取各位点土壤中的DNA。
2实时荧光PCR。将某位点的DNA连续稀释7个10倍梯度，设定DNA的终拷贝数分别为100-10-7n/ul，用来做相对定量的标曲
3.已知这类微生物的特征基因A,用A基因扩增引物扩增上步中不同稀释倍数DNA中的A基因及其他位点样品的A基因。设定阈值，通过Ct值计算出各位点中A基因模板的相对拷贝数，从而得出各位点某类微生物的相对多少
不知道我的想法是不是对的？请各位指教，我会虚心接受大家的意见。另外我看好多有要管家基因，我这里需要管家基因嘛？
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1楼 2011-10-01 13:40:52
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宁宁0320

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-10-02 19:26:54
楼主想用的是什么方法，相对定量还是绝对定量，
相对定量的话看家基因是一定要的，楼主的第二部的母的就是筛选最适模板浓度，即pcr效率较为接近100%
绝对定量不需要看家基因，需要做标准曲线，通过标准曲线来定量 ...

你好，在这个帖子看到你的解答，受益匪浅，我也想请教你一些问题，我想做虫子不同发育龄期某种菌的相对差异，也想做相对定量，可以像版主求助帖那样做吗？主要是我其实模板浓度没法控制。内参，引物都有了，求亲得援助！！！不甚感激！！！
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共生菌寻求实验盟友，互帮互助，实验进步
12楼2014-05-23 10:02:45
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

物质鉴定(金币+5): 2011-10-04 13:03:55
楼主想用的是什么方法，相对定量还是绝对定量，
相对定量的话看家基因是一定要的，楼主的第二部的母的就是筛选最适模板浓度，即pcr效率较为接近100%
绝对定量不需要看家基因，需要做标准曲线，通过标准曲线来定量，但是标准品难以获得，自己做的不一定符合要求，所以一般不采用这种方法。
一点浅见，希望对你有用。
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风雪夜归人
3楼2011-10-02 19:26:54
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xinongfish

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你做微生物含量的多少，完全可以用DGGE啊，RT-PCR主要是看基因表达量的差异的，例如不同处理条件下，二者的表达量差异
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4楼2011-10-03 10:29:36
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物质鉴定

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-10-02 19:26:54:
楼主想用的是什么方法，相对定量还是绝对定量，
相对定量的话看家基因是一定要的，楼主的第二部的母的就是筛选最适模板浓度，即pcr效率较为接近100%
绝对定量不需要看家基因，需要做标准曲线，通过标准曲线来定 ...

作微生物的话用什么看家基因好列，能给点意见吗？谢谢
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5楼2011-10-04 12:57:15
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