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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白提取
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白提取

大家谁用Tris-饱和酚提过蛋白啊，有没有具体的操作步骤 啊，我看文献上的说法不一，大家一般都怎么操作啊，
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追梦的人1987

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1楼 2011-09-21 19:29:52
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小娶个木

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

追梦的人1987(金币+2): 2011-09-22 08:57:27
恩 我做过 不过是提取植物蛋白  根据文献然后自己稍微修改 提出来的蛋白经过浓度测定觉得还行吧
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办法总比困难多
2楼2011-09-21 19:42:39
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小娶个木 at 2011-09-21 19:42:39:
恩 我做过 不过是提取植物蛋白  根据文献然后自己稍微修改 提出来的蛋白经过浓度测定觉得还行吧

能不能给我说一下具体步骤啊
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3楼2011-09-22 08:57:52
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小娶个木

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2011-09-22 08:57:52:
能不能给我说一下具体步骤啊

好的
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办法总比困难多
4楼2011-09-22 11:01:47
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小娶个木

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+10, BioEPI+1): 2011-09-23 17:50:13
对了 你是要 中文版还是因为版本啊？ 算了，估计你还是 小妹妹， 还是给你发中文版吧，个人试验，若有误差，不怪我

二、        水稻蛋白提取
样品处理：水稻根部及叶片部分
磨样：液氮保护下磨至细粉，分装至各离心管中，约2g；
蛋白提取：苯酚法
1、取分装好的样品约2.0g，加入EB1 6ml，PVPP 0.02g，PMSF 60ul，β-巯基乙醇120ul，Na3VO4、NaF 各6 ul；
注：
EB1: 0.7 M蔗糖、0.1 M的氯化钾、0.5 M Tris盐酸、10 mM EDTA，pH 7.5，
1%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），即(样品量的2%)2.0*1%=0.02g;
1mM  PMSF：用异丙醇配制成100mM 母液贮存于冰箱中锡箔纸待用，每次用完即扔掉，用时根据EB1的总体积进行稀释，如本例中为6ml，则取母液60ul 加入到离心管中，则浓度为60*100/6000=1mM
2 %的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）（v/v）：如本例中EB1 为6ml，则6*2%=120ul
0.2mM Na3VO4：配成0.2mmol/ml 母液，用时稀释即可，称取Na3VO4  0.03678g溶于1ml水，此时母液浓度为0.2 mmol/ml，如本例中EB1 为6ml，则需取6ul，6*0.2/6=0.2 mM
1 mM NaF：配成1mmol/ml 母液，用时稀释即可，称取NaF  0.042g溶于1ml水，此时母液浓度为1mmol/ml，如本例中EB1 为6ml，则需取6ul，6*1/6=1mM
2、低温斡旋10min（用冰盒保持温度在较低温度）
3、取出，加入水饱和苯酚6ml，同步骤2，低温斡旋10min，
4、用EB1 配平各管，在T=4℃，10000g 条件下离心40min；
5、将上层酚相吸出至另管中，加入5倍体积醋酸铵饱和甲醇溶液，置于-20℃冰箱过夜沉淀，
6、次日取出，配平后同样条件下离心40min，弃掉上清液，用冷丙酮清洗三遍，前两遍离心10min，后一遍离心20min，用氮气吹干待用
这是我试验本上的  一个字一个字帮你打印出来了
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追梦的人1987
办法总比困难多
5楼2011-09-22 11:05:36
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小娶个木 at 2011-09-22 11:05:36:
对了 你是要 中文版还是因为版本啊？ 算了，估计你还是 小妹妹， 还是给你发中文版吧，个人试验，若有误差，不怪我

二、        水稻蛋白提取
样品处理：水稻根部及叶片部分
磨样：液氮保护下磨至细粉，分装至各离 ...

太感谢了，可是你提的蛋白是用于双向吗，我怎么感觉这溶液里面的盐离子浓度太高了，到时会影响双向吗
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6楼2011-09-23 09:31:47
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小娶个木

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2011-09-23 09:31:47:
太感谢了，可是你提的蛋白是用于双向吗，我怎么感觉这溶液里面的盐离子浓度太高了，到时会影响双向吗

没关系啊  我双向电泳 质谱检测 都是用的这个做的啊  没发现有影响 小妹妹先做了再说吧 有很多参考文献你也可以参考
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办法总比困难多
7楼2011-09-23 21:30:03
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
恩，谢谢
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8楼2011-09-24 09:23:50
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小虾啄米

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小娶个木 at 2011-09-22 11:05:36:
对了 你是要 中文版还是因为版本啊？ 算了，估计你还是 小妹妹， 还是给你发中文版吧，个人试验，若有误差，不怪我

二、        水稻蛋白提取
样品处理：水稻根部及叶片部分
磨样：液氮保护下磨至细粉，分装至各离 ...

你给出的方法估计我也会用到，先谢啦！我想问一下，有没有相关这些试剂的作用，像PVPP之类的，相关文献可以分享一下吗，十分感谢哈！呵呵
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9楼2011-12-21 17:00:39
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小娶个木

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 小虾啄米 at 2011-12-21 17:00:39:
你给出的方法估计我也会用到，先谢啦！我想问一下，有没有相关这些试剂的作用，像PVPP之类的，相关文献可以分享一下吗，十分感谢哈！呵呵

这都什么时候给你的回复啊?好几个月了吧  忘了   给了你我的压箱子的实验步骤  居然没得居然现在才回复
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10楼2011-12-21 19:30:40
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