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蛋白提取
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| 大家谁用Tris-饱和酚提过蛋白啊，有没有具体的操作步骤 啊，我看文献上的说法不一，大家一般都怎么操作啊， |
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【答案】应助回帖
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silicare(金币+10, BioEPI+1): 2011-09-23 17:50:13
silicare(金币+10, BioEPI+1): 2011-09-23 17:50:13
对了 你是要 中文版还是因为版本啊？ 算了，估计你还是 小妹妹， 还是给你发中文版吧，个人试验，若有误差，不怪我 二、 水稻蛋白提取 样品处理：水稻根部及叶片部分 磨样：液氮保护下磨至细粉，分装至各离心管中，约2g； 蛋白提取：苯酚法 1、取分装好的样品约2.0g，加入EB1 6ml，PVPP 0.02g，PMSF 60ul，β-巯基乙醇120ul，Na3VO4、NaF 各6 ul； 注： EB1: 0.7 M蔗糖、0.1 M的氯化钾、0.5 M Tris盐酸、10 mM EDTA，pH 7.5， 1%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），即(样品量的2%)2.0*1%=0.02g; 1mM PMSF：用异丙醇配制成100mM 母液贮存于冰箱中锡箔纸待用，每次用完即扔掉，用时根据EB1的总体积进行稀释，如本例中为6ml，则取母液60ul 加入到离心管中，则浓度为60*100/6000=1mM 2 %的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）（v/v）：如本例中EB1 为6ml，则6*2%=120ul 0.2mM Na3VO4：配成0.2mmol/ml 母液，用时稀释即可，称取Na3VO4 0.03678g溶于1ml水，此时母液浓度为0.2 mmol/ml，如本例中EB1 为6ml，则需取6ul，6*0.2/6=0.2 mM 1 mM NaF：配成1mmol/ml 母液，用时稀释即可，称取NaF 0.042g溶于1ml水，此时母液浓度为1mmol/ml，如本例中EB1 为6ml，则需取6ul，6*1/6=1mM 2、低温斡旋10min（用冰盒保持温度在较低温度） 3、取出，加入水饱和苯酚6ml，同步骤2，低温斡旋10min， 4、用EB1 配平各管，在T=4℃，10000g 条件下离心40min； 5、将上层酚相吸出至另管中，加入5倍体积醋酸铵饱和甲醇溶液，置于-20℃冰箱过夜沉淀， 6、次日取出，配平后同样条件下离心40min，弃掉上清液，用冷丙酮清洗三遍，前两遍离心10min，后一遍离心20min，用氮气吹干待用 这是我试验本上的 一个字一个字帮你打印出来了 |
5楼2011-09-22 11:05:36
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