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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » mtDNA图像检测不理想，求原因
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busizhishen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-09 14:55:35:
把图传上来看看！如果跑得没有问题，我感觉是有一些核DNA以及降解了的RNA！
先给你篇文献看看。再做了解！[ Last edited by wanhscn on 2011-9 ...

不好意思这2天没怎么上网，我觉得是不是DNA酶加的量不够啊，导致的拖尾，请高手分析，万分感谢，谢谢您……
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11楼2011-09-11 22:20:56
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
引用回帖:
11楼: Originally posted by busizhishen at 2011-09-11 22:20:56:
不好意思这2天没怎么上网，我觉得是不是DNA酶加的量不够啊，导致的拖尾，请高手分析，万分感谢，谢谢您……

DNA酶你加了多少，你反应了多久后终止了？
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真相是最大的奢侈品
12楼2011-09-12 08:53:58
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busizhishen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-12 08:53:58:
DNA酶你加了多少，你反应了多久后终止了？

30g材料离心后得到2管沉淀，每管6ml悬浮液悬浮，加入6微升DNA酶600微升Mgcl2,冰浴1小时，不知道会不会这里出问题了？谢谢您……
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13楼2011-09-12 13:44:21
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busizhishen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-12 08:53:58:
DNA酶你加了多少，你反应了多久后终止了？

DNA酶单位是1U/μl  ,如果酶量少的话该加多少啊？加多了对实验有影响吗？终止时加入ＥＤＴＡ的终浓度是多少啊？条件也是冰浴吗？万分感谢……
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14楼2011-09-12 13:48:23
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
引用回帖:
11楼: Originally posted by busizhishen at 2011-09-11 22:20:56:
不好意思这2天没怎么上网，我觉得是不是DNA酶加的量不够啊，导致的拖尾，请高手分析，万分感谢，谢谢您……

这次带还没有上一次的明显。
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真相是最大的奢侈品
15楼2011-09-12 15:53:34
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
（1）线粒体的提取及纯化
①剪苗匀浆：用剪刀沿距胚轴05-1cm处将黄化苗部分剪下，并剪碎成不长于0.5cm的小碎段 (以下操作未经注明，均在4℃进行)，按5mL/g鲜重加入匀浆缓冲液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA；5mmol/L EDTA），用预冷的高速组织匀浆器捣碎3-5次，每次5-8s，四层纱布过滤，收集滤液。
②收集粗提线粒体：滤液经2 000g离心15min后，收集上清，17 000g离心10min，收集沉淀，沉淀即为粗提线粒体。
③去核DNA：往此沉淀中加入0.1mL/g鲜重的酶解缓冲液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA），用毛笔轻轻悬浮沉淀，悬浮液再经1 000g离心10min，取上清，加入DNaseI及MgCl2溶液，使两者的终浓度分别为100μg/mL和10mmol/L，在4℃下反应1h后，加入EDTA溶液至终浓度50mmol/L，终止DNase I的反应。
④利用蔗糖衬垫法纯化线粒体：将上述用DNase I处理过的线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液（0.6mol/L蔗糖；10mmol/L Tris-HCl，pH7.5；20mmol/L EDTA）的离心管中，Shelf缓冲液的用量为0.5mL/(g鲜重)。经17 000g，离心15min后，弃上清，用0.1mL/(g鲜重)的匀浆缓冲液悬浮沉淀，再将此线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液的离心管中(Shelf缓冲液用量同上)，17 000g离心15min，所得沉淀即为纯化的线粒体。
（2）线粒体DNA的提取
①去蛋白杂质：在纯化后的线粒体沉淀中加入裂解缓冲液（50mmol/LTris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA）0.1mL/(g鲜重)，混匀沉淀，再加入蛋白酶K和10%的SDS溶液，使两者的最终浓度分别为100μg/mL和1%，充分混匀，37℃保温2h以上，其间每隔10min振荡1次。
②抽提、低温沉淀：裂解液经等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次后，12 000g离心取上清，再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的预冷异丙醇，-20℃沉淀0.5h以上。
③收集、洗涤、保存：12 000g离心10min，收集沉淀，70%乙醇洗涤1~2次，沉淀室温凉干，溶于适当体积的TE缓冲液或双蒸水中，取5ml用于琼脂糖检测，余下于-20℃保存备用。
这个是我师兄4年前的protocol！
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真相是最大的奢侈品
16楼2011-09-12 16:19:56
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
至于你的实验应该加多少，我也不确定！注：上面protocol是提水稻的。其中，去核DNA这一步很关键。你自己再看看。
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真相是最大的奢侈品
17楼2011-09-12 16:28:50
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busizhishen

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励及时反馈！ 2011-09-13 15:35:41
引用回帖:
17楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-12 16:28:50:
至于你的实验应该加多少，我也不确定！注：上面protocol是提水稻的。其中，去核DNA这一步很关键。你自己再看看。

好的，谢谢您，真的太感谢您了，过几天再做一次，有什么问题我再向您咨询，再一次感谢……
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18楼2011-09-12 23:23:16
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
引用回帖:
18楼: Originally posted by busizhishen at 2011-09-12 23:23:16:
好的，谢谢您，真的太感谢您了，过几天再做一次，有什么问题我再向您咨询，再一次感谢……

希望能这次能一次搞定。
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真相是最大的奢侈品
19楼2011-09-12 23:24:43
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