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busizhishen

铜虫 (小有名气)

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[求助] mtDNA图像检测不理想，求原因

用密度梯度离心提取mtDNA,图像检测后简直太打击人了……跪求各位大侠，帮小弟分析一下原因，谢谢大家

[ Last edited by dhd997 on 2011-9-9 at 07:57 ]

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1楼 2011-09-08 23:46:19

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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

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（1）线粒体的提取及纯化
①剪苗匀浆：用剪刀沿距胚轴05-1cm处将黄化苗部分剪下，并剪碎成不长于0.5cm的小碎段 (以下操作未经注明，均在4℃进行)，按5mL/g鲜重加入匀浆缓冲液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA；5mmol/L EDTA），用预冷的高速组织匀浆器捣碎3-5次，每次5-8s，四层纱布过滤，收集滤液。
②收集粗提线粒体：滤液经2 000g离心15min后，收集上清，17 000g离心10min，收集沉淀，沉淀即为粗提线粒体。
③去核DNA：往此沉淀中加入0.1mL/g鲜重的酶解缓冲液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA），用毛笔轻轻悬浮沉淀，悬浮液再经1 000g离心10min，取上清，加入DNaseI及MgCl2溶液，使两者的终浓度分别为100μg/mL和10mmol/L，在4℃下反应1h后，加入EDTA溶液至终浓度50mmol/L，终止DNase I的反应。
④利用蔗糖衬垫法纯化线粒体：将上述用DNase I处理过的线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液（0.6mol/L蔗糖；10mmol/L Tris-HCl，pH7.5；20mmol/L EDTA）的离心管中，Shelf缓冲液的用量为0.5mL/(g鲜重)。经17 000g，离心15min后，弃上清，用0.1mL/(g鲜重)的匀浆缓冲液悬浮沉淀，再将此线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液的离心管中(Shelf缓冲液用量同上)，17 000g离心15min，所得沉淀即为纯化的线粒体。
（2）线粒体DNA的提取
①去蛋白杂质：在纯化后的线粒体沉淀中加入裂解缓冲液（50mmol/LTris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA）0.1mL/(g鲜重)，混匀沉淀，再加入蛋白酶K和10%的SDS溶液，使两者的最终浓度分别为100μg/mL和1%，充分混匀，37℃保温2h以上，其间每隔10min振荡1次。
②抽提、低温沉淀：裂解液经等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次后，12 000g离心取上清，再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的预冷异丙醇，-20℃沉淀0.5h以上。
③收集、洗涤、保存：12 000g离心10min，收集沉淀，70%乙醇洗涤1~2次，沉淀室温凉干，溶于适当体积的TE缓冲液或双蒸水中，取5ml用于琼脂糖检测，余下于-20℃保存备用。
这个是我师兄4年前的protocol！