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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠PCR克隆大片段
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microz

新虫 (初入文坛)

[求助] 重叠PCR克隆大片段

因为基因组GC含量很高，有一个3000bp的大片段怎么也扩增不出来。

想分成两段，采用重叠PCR试试。

问一下重叠部分最短20bp，最长能有多少？是否没有限制？

或者我分别克隆两个片段，这两个片段之间有几百bp的重叠，是否依然能实现PCR扩增？

[ Last edited by microz on 2011-9-1 at 20:45 ]
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1楼 2011-09-01 20:43:27
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

GC含量高，我以前用的是KOD专门扩高级结构的（可扩10K），测序的时候也是送到大连宝生物的，150元一个反应。
重叠20bp太少，就怕你们老板不信结果。
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真相是最大的奢侈品
4楼2011-09-05 21:09:53
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microz

新虫 (初入文坛)
没人做过吗？

求解答
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3楼2011-09-05 21:02:42
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): ok 2011-09-05 21:19:13
可以重叠的，重叠一般可以到200bp左右，GC含量高的话就用TAKARA的LA Taq酶扩就可以了。长的片段一般是采用分段扩增的方式，再拼凑起来。一般每一段都做下TA克隆，克隆到T载体上效果比较好，直接PCR结果扩的话可能会信号不大好。我是做链霉菌的，GC含量非常的高，就是用的TAKARA的LA Taq酶扩增的，目的片段为2400bp，分三段来扩，每一段约为1000bp，每次测序都正反方向测通，防止因测序信号不好而造成的碱基错误。测序好了再用软件拼接就可以得到完整的基因的序列了。
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5楼2011-09-05 21:15:47
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