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[求助]
重叠PCR克隆大片段
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因为基因组GC含量很高，有一个3000bp的大片段怎么也扩增不出来。 想分成两段，采用重叠PCR试试。 问一下重叠部分最短20bp，最长能有多少？是否没有限制？ 或者我分别克隆两个片段，这两个片段之间有几百bp的重叠，是否依然能实现PCR扩增？ [ Last edited by microz on 2011-9-1 at 20:45 ] |
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3楼2011-09-05 21:02:42
wanhscn
木虫 (职业作家)
哲学@草根
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4楼2011-09-05 21:09:53
【答案】应助回帖
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): ok 2011-09-05 21:19:13
wanhscn(金币+3): ok 2011-09-05 21:19:13
| 可以重叠的，重叠一般可以到200bp左右，GC含量高的话就用TAKARA的LA Taq酶扩就可以了。长的片段一般是采用分段扩增的方式，再拼凑起来。一般每一段都做下TA克隆，克隆到T载体上效果比较好，直接PCR结果扩的话可能会信号不大好。我是做链霉菌的，GC含量非常的高，就是用的TAKARA的LA Taq酶扩增的，目的片段为2400bp，分三段来扩，每一段约为1000bp，每次测序都正反方向测通，防止因测序信号不好而造成的碱基错误。测序好了再用软件拼接就可以得到完整的基因的序列了。 |
5楼2011-09-05 21:15:47
100