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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 斑斑热心哦! 2011-09-20 18:08:45
水稻mtDNA

(1)线粒体的提取及纯化
①剪苗匀浆:用剪刀沿距胚轴05-1cm处将黄化苗部分剪下,并剪碎成不长于0.5cm的小碎段 (以下操作未经注明,均在4℃进行),按5mL/g鲜重加入匀浆缓冲液(0.5mol/L蔗糖;50mmol/L Tris-HCl,pH7.5;1.0%BSA;5mmol/L EDTA),用预冷的高速组织匀浆器捣碎3-5次,每次5-8s,四层纱布过滤,收集滤液。
②收集粗提线粒体:滤液经2 000g离心15min后,收集上清,17 000g离心10min,收集沉淀,沉淀即为粗提线粒体。
③去核DNA:往此沉淀中加入0.1mL/g鲜重的酶解缓冲液(0.5mol/L蔗糖;50mmol/L Tris-HCl,pH7.5;1.0%BSA),用毛笔轻轻悬浮沉淀,悬浮液再经1 000g离心10min,取上清,加入DNaseI及MgCl2溶液,使两者的终浓度分别为100μg/mL和10mmol/L,在4℃下反应1h后,加入EDTA溶液至终浓度50mmol/L,终止DNase I的反应。
④利用蔗糖衬垫法纯化线粒体:将上述用DNase I处理过的线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液(0.6mol/L蔗糖;10mmol/L Tris-HCl,pH7.5;20mmol/L EDTA)的离心管中,Shelf缓冲液的用量为0.5mL/(g鲜重)。经17 000g,离心15min后,弃上清,用0.1mL/(g鲜重)的匀浆缓冲液悬浮沉淀,再将此线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液的离心管中(Shelf缓冲液用量同上),17 000g离心15min,所得沉淀即为纯化的线粒体。
(2)线粒体DNA的提取
①去蛋白杂质:在纯化后的线粒体沉淀中加入裂解缓冲液(50mmol/LTris-HCl,pH 8.0;50mmol/L EDTA)0.1mL/(g鲜重),混匀沉淀,再加入蛋白酶K和10%的SDS溶液,使两者的最终浓度分别为100μg/mL和1%,充分混匀,37℃保温2h以上,其间每隔10min振荡1次。
②抽提、低温沉淀:裂解液经等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次后,12 000g离心取上清,再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的预冷异丙醇,-20℃沉淀0.5h以上。
③收集、洗涤、保存:12 000g离心10min,收集沉淀,70%乙醇洗涤1~2次,沉淀室温凉干,溶于适当体积的TE缓冲液或双蒸水中,取5ml用于琼脂糖检测,余下于-20℃保存备用
这种提法,最后可用RNA酶处理一下,否者RNA较多,跑的胶不好看!
附件中式小麦mtDNA的提取![ Last edited by wanhscn on 2011-9-20 at 11:28 ]
真相是最大的奢侈品
8楼2011-09-20 11:24:12
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匿名

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2楼2011-08-25 13:06:03
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

只提取过动物组织的线粒体
人有绝交,才有至交!
3楼2011-08-30 11:18:36
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kaixin179

金虫 (小有名气)


西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-09-01 18:10:54
我们提取过棉花线粒体体的DNA, 用的是棉花的一周大小黄化幼苗,用的是上海杰美基因的试剂盒,缺点是提取量少,步骤较多!
生物必成朝阳产业,甘做拓荒牛!
4楼2011-09-01 10:18:56
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tymayer

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 晴天1882 at 2011-08-30 11:18:36:
只提取过动物组织的线粒体

请教一下,我用大鼠肝脏组织提取线粒体,杂质很多,是什么原因?
5楼2011-09-19 14:01:49
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by tymayer at 2011-09-19 14:01:49:
请教一下,我用大鼠肝脏组织提取线粒体,杂质很多,是什么原因?

你是用詹姆斯绿染色在显微镜下看到很多杂志吗?这个原因我也不好说啊!中途离心取沉淀和上清的次数有点多,离心时间和离心力应该都会有影响的。
人有绝交,才有至交!
6楼2011-09-20 09:17:18
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tymayer

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 晴天1882 at 2011-09-20 09:17:18:
你是用詹姆斯绿染色在显微镜下看到很多杂志吗?这个原因我也不好说啊!中途离心取沉淀和上清的次数有点多,离心时间和离心力应该都会有影响的。

我是用的mito-tracker green 染色在荧光显微镜下观察的,老师说这个染料的特异性值得怀疑,看起来一些杂质膜片都被染色了。我用的是dounce匀浆器,觉得自己匀浆做的不太好,这个匀浆器你用过吗?
7楼2011-09-20 09:23:50
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海的冷漠

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 晴天1882 at 2011-08-30 11:18:36
只提取过动物组织的线粒体

我想知道动物组织的怎么提取,谢谢
9楼2013-07-16 08:35:28
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Jeana2

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Rain_loyer at 2011-08-25 13:06:03
我做的是藻类的线粒体分离提取,我的要求是高纯的的线粒体,至少是没有核的污染。如果前辈们有提取叶绿体线粒体DNA的方法(PS去除核DNA污染的),请介绍给我看看吧,3Q~

你好~我现在也要分离提取线粒体DNA,不知你之前完成得怎样?可以分享些经验么?
10楼2015-03-05 18:44:54
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