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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助叶绿体线粒体分离提取
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【分子生物】EPI帖 生物科学

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1楼 2011-08-25 12:44:41
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 斑斑热心哦！ 2011-09-20 18:08:45
水稻mtDNA

（1）线粒体的提取及纯化
①剪苗匀浆：用剪刀沿距胚轴05-1cm处将黄化苗部分剪下，并剪碎成不长于0.5cm的小碎段 (以下操作未经注明，均在4℃进行)，按5mL/g鲜重加入匀浆缓冲液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA；5mmol/L EDTA），用预冷的高速组织匀浆器捣碎3-5次，每次5-8s，四层纱布过滤，收集滤液。
②收集粗提线粒体：滤液经2 000g离心15min后，收集上清，17 000g离心10min，收集沉淀，沉淀即为粗提线粒体。
③去核DNA：往此沉淀中加入0.1mL/g鲜重的酶解缓冲液（0.5mol/L蔗糖；50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1.0%BSA），用毛笔轻轻悬浮沉淀，悬浮液再经1 000g离心10min，取上清，加入DNaseI及MgCl2溶液，使两者的终浓度分别为100μg/mL和10mmol/L，在4℃下反应1h后，加入EDTA溶液至终浓度50mmol/L，终止DNase I的反应。
④利用蔗糖衬垫法纯化线粒体：将上述用DNase I处理过的线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液（0.6mol/L蔗糖；10mmol/L Tris-HCl，pH7.5；20mmol/L EDTA）的离心管中，Shelf缓冲液的用量为0.5mL/(g鲜重)。经17 000g，离心15min后，弃上清，用0.1mL/(g鲜重)的匀浆缓冲液悬浮沉淀，再将此线粒体悬液小心铺在装有Shelf缓冲液的离心管中(Shelf缓冲液用量同上)，17 000g离心15min，所得沉淀即为纯化的线粒体。
（2）线粒体DNA的提取
①去蛋白杂质：在纯化后的线粒体沉淀中加入裂解缓冲液（50mmol/LTris-HCl，pH 8.0；50mmol/L EDTA）0.1mL/(g鲜重)，混匀沉淀，再加入蛋白酶K和10%的SDS溶液，使两者的最终浓度分别为100μg/mL和1%，充分混匀，37℃保温2h以上，其间每隔10min振荡1次。
②抽提、低温沉淀：裂解液经等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提1次后，12 000g离心取上清，再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和等体积的预冷异丙醇，-20℃沉淀0.5h以上。
③收集、洗涤、保存：12 000g离心10min，收集沉淀，70%乙醇洗涤1~2次，沉淀室温凉干，溶于适当体积的TE缓冲液或双蒸水中，取5ml用于琼脂糖检测，余下于-20℃保存备用
这种提法，最后可用RNA酶处理一下，否者RNA较多，跑的胶不好看！
附件中式小麦mtDNA的提取！[ Last edited by wanhscn on 2011-9-20 at 11:28 ]
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真相是最大的奢侈品
8楼2011-09-20 11:24:12
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普通回帖

匿名

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2楼2011-08-25 13:06:03
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

只提取过动物组织的线粒体
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人有绝交，才有至交！
3楼2011-08-30 11:18:36
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kaixin179

金虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-09-01 18:10:54
我们提取过棉花线粒体体的DNA, 用的是棉花的一周大小黄化幼苗，用的是上海杰美基因的试剂盒，缺点是提取量少，步骤较多！
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生物必成朝阳产业，甘做拓荒牛！
4楼2011-09-01 10:18:56
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tymayer

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晴天1882 at 2011-08-30 11:18:36:
只提取过动物组织的线粒体

请教一下，我用大鼠肝脏组织提取线粒体，杂质很多，是什么原因？
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5楼2011-09-19 14:01:49
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by tymayer at 2011-09-19 14:01:49:
请教一下，我用大鼠肝脏组织提取线粒体，杂质很多，是什么原因？

你是用詹姆斯绿染色在显微镜下看到很多杂志吗？这个原因我也不好说啊！中途离心取沉淀和上清的次数有点多，离心时间和离心力应该都会有影响的。
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人有绝交，才有至交！
6楼2011-09-20 09:17:18
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tymayer

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 晴天1882 at 2011-09-20 09:17:18:
你是用詹姆斯绿染色在显微镜下看到很多杂志吗？这个原因我也不好说啊！中途离心取沉淀和上清的次数有点多，离心时间和离心力应该都会有影响的。

我是用的mito-tracker green 染色在荧光显微镜下观察的，老师说这个染料的特异性值得怀疑，看起来一些杂质膜片都被染色了。我用的是dounce匀浆器，觉得自己匀浆做的不太好，这个匀浆器你用过吗？
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7楼2011-09-20 09:23:50
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海的冷漠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晴天1882 at 2011-08-30 11:18:36
只提取过动物组织的线粒体

我想知道动物组织的怎么提取，谢谢
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9楼2013-07-16 08:35:28
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Jeana2

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Rain_loyer at 2011-08-25 13:06:03
我做的是藻类的线粒体分离提取，我的要求是高纯的的线粒体，至少是没有核的污染。如果前辈们有提取叶绿体线粒体DNA的方法（PS去除核DNA污染的），请介绍给我看看吧，3Q~

你好~我现在也要分离提取线粒体DNA，不知你之前完成得怎样？可以分享些经验么？
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10楼2015-03-05 18:44:54
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