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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接PCR检测
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 连接PCR检测

对连接转化挑取的菌液进行PCR反应，为了验证连接成功，扩增载体上的目的基因2000bp, 为什么会出来小分子量1000左右的条带啊 ，是PCR的问题，还是我的连接失败啊，原因在何处啊？



各位高手帮着分析一下啊
谢谢了
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1楼 2011-08-08 08:17:43
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DXY1

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 希望继续交流 2011-08-08 18:17:41
暗夜懒猫(金币+1): 2011-08-25 08:14:07
用菌液做PCR不是很可靠，因为在菌液中除了你的目的基因外，还有其他的基因，你不能保证你的引物只会扩增出你的目的基因，也会扩增出其他的基因，除非你把菌的整个基因组都测序一遍，确定你的引物就只会扩增你的目的基因。
用菌液做PCR一般是运用于槽式PCR，你把质粒提出再做PCR，看看结果
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11楼2011-08-08 15:04:50
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-08 18:16:42
出现过同样的问题，
可能是引物特异性不好，扩增出载体的部分片段造成的，建议选择一两个亮点的，提质粒酶切鉴定看看。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-08-08 08:38:26
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-08-08 18:16:54
你之前PCR的时候很完整么？？还有你连得是T载体还是通过酶切位点连接的？？怀疑你的引物有问题，特异性不好
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3楼2011-08-08 09:31:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:04
1.可能是你的引物特异性不好，在模板的其他位置有非特异性扩增
2.还有一个原因是气溶胶的污染
你的目的条带已经扩出来说明应该是连上了，再做的酶切验证一下
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4楼2011-08-08 09:38:41
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