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lasteye金虫 (小有名气)
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[求助]
请教：结构生物学的研究手段NMR和单晶衍射方法哪个更可靠？
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本人是做药化的，在阅读文献的过程中发现，抗癌药物epothilone A核磁共振和单晶衍射得到的微管蛋白结合构象不一致，文献见附件。就目前epothilone的构效关系研究数据来看，NMR模型更可靠一些。 我想请教一下做结构生物学的专家，这两种实验手段得到的同一个小分子的结合构象为何会出现这样大的差别？难道现在广泛采用的NMR和单晶衍射解析手段得到的结构不见得完全可靠？谢谢！ NMR： Teresa Carlomagno, et al. The High-Resolution Solution Structure of Epothilone ABound to Tubulin: An Understanding of the Structure–Activity Relationships for a Powerful Class of Antitumor Agents. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2511-2515. 单晶衍射： James H. Nettles, et al. The Binding Mode of Epothilone A on α,ß-Tubulin by Electron Crystallography. Science, 2004, 305, 866-869.[ Last edited by lasteye on 2011-8-3 at 12:57 ] |
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brightfuture01
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adslye(金币+8): 多谢交流指教~祝顺利！ 2011-08-05 19:16:43
adslye(金币+8): 多谢交流指教~祝顺利！ 2011-08-05 19:16:43
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所以，我的问题是：大分子的蛋白晶体构像会随着buffer不同而改变吗？（这类实验应该有专门的buffer吧，加入特殊物质，除去干扰）如果是的话这一类的研究不是很头疼这个问题。辛苦结晶出来的只是一种存在形式。 这个问题的答案是YES，蛋白纯化过程中使用的buffer组成或者pH不同，最后对其晶体结构可能会有影响的（但不是全部），我们实验室一个兄弟的晶体在一种buffer情况下是单聚状态，可以长出晶体；另一种buffer情况下分子筛过完二聚体占大部分，最后也可以长出晶体。但是，两种情况下的晶体是不同构象的，前一个长出来一个晶胞里面是一个蛋白分子，而另一个是两个蛋白分子，空间群也不一样。不知道这样说你能否明白。 2.最后，偷偷懒。能大概1，,2句话描述下蛋白结晶的过程吗？嘿嘿~~ 过程说起来很简单：目的蛋白先纯化到95%以上纯度（越纯越好），一般都是10mg/mL的浓度，用坐滴法或者悬滴法初筛结晶条件（有商售Kit），如果有条件中长出了晶体（确定是蛋白晶），然后在用网格法在此条件基础上进行拉网式优化，最后获得衍射较好的晶体。可能有些术语对你来说有点陌生，可以google下，很好理解的。 |
12楼2011-08-04 23:57:16
whb8161
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3楼2011-08-04 11:21:01
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adslye(金币+7): 鼓励深入交流！祝顺利！ 2011-08-04 16:46:49
adslye(金币+7): 鼓励深入交流！祝顺利！ 2011-08-04 16:46:49
| 我觉得同一个蛋白用两种不同的方法解析出来不同的构象是非常有可能的，X-ray 晶体衍射依赖于获得可衍射的晶体，而晶体的生长所需要的溶液以及沉淀剂和NRM时蛋白所处的溶液大有区别。蛋白在不同的buffer中构象难免会有变化，所以用这两种方法获得的数据，解析出来难免会有所差异，差异的双方都可能是正确的，并没有谁对谁错。如果要刨根问底的话，蛋白在细胞中是出于一种可溶状态的，你体外结晶获得的结构真的是蛋白在体内的真实结构么？ |
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adslye4楼2011-08-04 12:29:52